Laserablation und Intravitalmikroskopie zur Untersuchung des Darmumbaus

Verletzungsmodelle sind unabdingbar, um die Regeneration in vivo zu untersuchen, jedoch erweist sich die Untersuchung der Regeneration im Darm als technische Herausforderung. Das Fehlen von longitudinalen Bildgebungsprotokollen hat einen tieferen Einblick in die Dynamik auf Zell- und Gewebeebene verhindert, die die Darmregeneration orchestriert. In diesem Protokoll beschreiben wir eine intravitale Mikroskopiemethode, die lokal Gewebeschäden auf der Ebene einzelner Krypten induziert und die regenerative Reaktion des Darmepithels in der lebenden Maus auf photonenbasierte Laserablationsschäden einzelner Krypten oder größerer Darmfelder in einer zeit- und raumkontrollierten Weise verfolgt.

Die anschließende, langfristige, repetitive intravitale Bildgebung ermöglicht die Verfolgung des geschädigten Bereichs im Laufe der Zeit und ermöglicht die Überwachung der Kryptendynamik während der Gewebeerholung über einen Zeitraum von mehreren Wochen. Induzieren Sie Mäuse, indem Sie in Sonnenblumenöl gelöstes Tamoxifen vier bis sechs Wochen vor der Operation injizieren. Analgesie anwenden, 30 Minuten vor der Operation 200 Mikroliter Buprenorphin subkutan injizieren.

Verabreichen Sie Carprofen 24 Stunden vor der Operation mit Trinkwasser. Führen Sie autoklavierte, sterile chirurgische Instrumente in den Biohazard-Schrank ein. Schalten Sie das Heizkissen ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein.

Schalten Sie die Temperaturkontrollkammer des Mikroskops mindestens vier Stunden vor der Bildgebung ein. Halten Sie die Temperatur in der Klimakammer stabil bei 37 Grad Celsius. Schalten Sie das Zwei-Photonen-Mikroskop, den Scanner und den Laser ein.

Starten Sie die Imaging-Software. Stellen Sie die Wellenlänge des Lasers auf 960 Nanometer ein und öffnen Sie den Verschluss. Betäuben Sie die Maus mit zwei bis 3%igem Isofluran und legen Sie sie auf ein Heizkissen, das mit einem sterilen Tuch bedeckt ist.

Überprüfen Sie die Narkosetiefe, indem Sie die Häufigkeit und die Qualität der Atmung bei einem Atemzug pro Sekunde beurteilen und den Reflex der Maus überprüfen. Bedecken Sie die Augen der Maus mit Augensalbe. Injizieren Sie 200 Mikroliter vorgewärmte sterile Kochsalzlösung subkutan.

Rasieren Sie den Bauch und entfernen Sie die Haare. Wechseln Sie das sterile Tuch im Operationsbereich. Führen Sie die rektale Sonde ein, um die Temperatur der Maus zu überwachen.

Die Temperatur sollte ungefähr bei 37 Grad Celsius liegen. Tragen Sie ein neues Paar sterile Handschuhe. Reinigen Sie den Operationsbereich kreisförmig mit abwechselnden Peelings aus antiseptischer Lösung, gefolgt von dreimal 80%igem Ethanol.

Decken Sie die Maus mit einem sterilen OP-Tuch ab. Überprüfen Sie den Reflex der Maus. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen 10 Millimeter großen vertikalen Schnitt in der Mittellinie durch die Haut.

Schneiden Sie die Linea alba mit der Schere ein, um die geraden Bauchmuskeln zu trennen und den Bauch zu öffnen. Finden Sie den Blinddarm der Maus mit einem sterilen Wattestäbchen, das mit vorgewärmter Kochsalzlösung getränkt ist, um es als Referenzpunkt zu verwenden. Machen Sie einen kleinen Schnitt in ein Stück Gaze, befeuchten Sie es mit vorgewärmter steriler Kochsalzlösung und legen Sie es über den Einschnitt.

Nehmen Sie den Darm mit sterilen Wattestäbchen heraus, die in vorgewärmter steriler Kochsalzlösung getränkt sind. Halten Sie den Darm mit Feuchtigkeit versorgt, indem Sie sterilisierte, vorgewärmte Kochsalzlösung hinzufügen. Legen Sie die Maus in eine vorgewärmte sterile Bildgebungsbox.

Legen Sie den Darm auf das sterile Glas. Legen Sie den Kopf der Maus in das Inhalationsröhrchen der Imaging-Box. Befestigen Sie die Maus bei Bedarf mit steriler flexibler Folie und Klebeband.

Legen Sie die Bildbox mit der Maus in die Mikroskopkammer. Überwachen Sie die Maus während der Bildgebung, indem Sie alle 15 Minuten die Frequenz und Tiefe der Atmung sowie die Temperatur über eine rektale Sonde überprüfen. Isofluran sollte zwischen einem und 2 % gehalten werdenFinden Sie eine Region im Darm mit den IPs des Mikroskops.

Erhalten Sie mit der internen Kamera des Mikroskops eine Weitwinkelansicht des interessierenden Bereichs. Bilde den interessierenden Bereich mit dem 960-Nanometer-Laser des Multiphotonenmikroskops ab. Passen Sie die Laserleistung und Wellenlänge entsprechend den im Experiment verwendeten Fluorformen an.

In diesem Beispiel besteht die in Krypten exprimierte Membran aus rot fluoreszierendem Protein und wird stochastisch mit grün fluoreszierendem Protein markiert, nachdem sie mit einer niedrigen Dosis Tamoxifen induziert wurde. Erfassen Sie einen 10- bis 20-stufigen Z-Stapel von drei Mikrometern der interessierenden Region. Wählen Sie zuvor eine einzelne Position oder mehrere Positionen aus dem Kachelbild aus.

Verwenden Sie die Sprengpunktkalibrierungsfunktion in der Bildbearbeitungssoftware bei einer Auflösung von 32 und 124 x 124 Pixeln mit einer Scangeschwindigkeit von 400 Hertz unter Verwendung der bidirektionalen Scan-Eigenschaft für drei bis 10 Sekunden, je nach Größe des angestrebten Schadens. Die Schädigung im Kryptenbereich ist an einer Erhöhung der Autofluoreszenz sowohl im Grün- als auch im Rotkanal zu erkennen. Erfassen Sie nach der Ablation Z-Stapel der beschädigten Regionen, um die Lokalisation und das Ausmaß der Schädigung zu bestätigen.

Wiederholen Sie die beiden vorherigen Schritte für mehrere Regionen in derselben Maus. Legen Sie die Maus noch unter Narkose auf eine sterile Nahtstelle und decken Sie sie mit einem sterilen Tuch ab. Führen Sie den freiliegenden Darm mit sterilen Wattestäbchen, die mit vorgewärmter steriler Kochsalzlösung getränkt sind, wieder in den Bauch ein.

Nähen Sie die Linea alba durch eine einfache kontinuierliche Naht mit resorbierbarem Nahtmaterial. Verschließen Sie die Enden der Naht mit chirurgischen Knoten. Wiederholen Sie den gleichen Schritt mit der Hautschicht.

Schalten Sie die Isofluran-Station aus, reinigen und sterilisieren Sie die Imaging-Box und das Inlay. Lassen Sie die Maus sich von der Operation erholen, während der Käfig eine Stunde lang auf das Heizkissen gelegt wird. Injizieren Sie sechs bis 12 Stunden nach der Operation 200 Mikroliter Buprenorphin subkutan.

Verabreichen Sie Carprofen 72 Stunden nach der Operation mit Trinkwasser. Wiegen Sie die Maus und überwachen Sie das Wohlbefinden eine Woche lang täglich nach der Operation. Zum zweiten Zeitpunkt mindestens eine Woche nach der ersten Bildgebungssitzung wiederholen Sie die Operation und die intravitale Bildgebung.

Verwenden Sie das Muster der Blutgefäße, um das gleiche Bild der interessierenden Regionen zum ersten Zeitpunkt wiederzufinden. Wenn die Maus nicht zu einem anderen Zeitpunkt abgebildet werden soll, opfern Sie die Maus, indem Sie eine zervikale Luxation unter Narkose durchführen. Andernfalls fahren Sie mit der Schließung der Operationsstelle und der postoperativen Versorgung fort.

K19-Cre ERT mTmG-Mäusen wurde vier bis sechs Wochen vor der Operation und der ersten Bildgebungssitzung Tamoxifen injiziert, um eine stochastische Markierung von Zellen mit GFP zu induzieren. Nach der chirurgischen Freilegung des Darms der Maus und der Aufnahme von Kamera- und Fluoreszenzbildern der interessierenden Region werden die Bruchpunkteinstellungen des Multiphotonenlasers verwendet, um Krypten abzutragen. Die Initiierung der Schädigung ist an einer Erhöhung der Autofluoreszenz sowohl im grünen als auch im roten Kanal zu erkennen.

Die gleiche Prozedur wird einen Monat später wiederholt, und das Gefäßsystem wird als Orientierungspunkt verwendet, um die gleiche Region wiederzufinden. Mit Hilfe des Lgr5-eGFP-Konfettimodells können Krypten, die mit verschiedenen Farben beschriftet sind, im Laufe der Zeit verfolgt werden, um die Dynamik der Erholung abzubilden. In diesem Beispiel drücken Krypten in Grün das Lgr5 Cre aus, und eine Krypta in Magenta ist mit Konfettifarbe beschriftet.

Zwei Wochen nach der Laserablation werden unterschiedliche Regenerationsmodi beobachtet. Einige Regionen bleiben unverändert, während andere Regionen eine Umgestaltung in Form von Kryptenspaltung aufweisen, also die Teilung einer Krypta in zwei oder die Fusion, die Verschmelzung zweier Krypten zu einer oder das Verschwinden der Krypta. Die Laserablation in Kombination mit der intravitalen Mikroskopiemethode begrenzt die Schädigung auf eine definierte Region von Interesse.

Dies ermöglicht es uns, sowohl den Ort des Schadens als auch das Schadensausmaß zu kontrollieren. Der Schweregrad der Schädigung kann moduliert werden, um Krypten oder ganze Darmfelder abzutragen, um uns über die regenerative Reaktion auf der Kryptenskala zu informieren. Neben der räumlichen Kontrolle ermöglicht die Laserablation auch eine präzise zeitliche Begrenzung des Auftretens der Schädigung sowie die Abbildung desselben Organs sowohl unter homöostatischen als auch unter regenerierenden Bedingungen in derselben Maus, wodurch die Präzision früherer Verletzungsmodelle übertroffen wird.

Die Anwendung der Laserablation und der repetitiven intravitalen Bildgebung kann als Plattform für eine Vielzahl von Forschungsfragen und verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen genutzt werden, die sich von der Regeneration über die Immunologie bis hin zur Krebsforschung erstrecken.