Name: Gen-Editierung von primären Rhesusaffen-B-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Lernen Sie die effiziente Gen-Editierung primärer Rhesusaffen-B-Zellen mit CRISPR/Cas9 und rAAV6 für präklinische B-Zell-Therapieforschung. Diese Methode ermöglicht präzise genetische Modifikationen.

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Wir danken Harry B. Gristick und Pamela Bjorkman für die Bereitstellung des RC1-Antigens und den gesamten Laboratorien von Nussenzweig und Martin für die kritische Diskussion. Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der Bill and Melinda Gates Foundation INV-002777 (an M.C.N.) und das intramurale Forschungsprogramm des National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, unterstützt. (R.G. und M.A.M). M.C.N. ist ein HHMI-Ermittler.

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<li>Escolano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+expands+B+cells+specific+to+HIV-1+V3+glycan+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunization expands B cells specific to HIV-1 V3 glycan in mice and macaques.</a> Nature. 570 (7762), 468-473 (2019).</li>
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</ol>

Interessenkonflikte werden nicht deklariert.

Die hier vorgestellten Protokolle bieten eine schnelle und effiziente Methode zur Erzeugung hoher Ausbeuten und Titer von rAAV6s als HDRTs und neuartige Methoden zur effizienten Gen-Editierung primärer Rhesusaffen-B-Zellen in vitro.
Das rAAV6-Produktionsprotokoll ist vergleichsweise einfach und schnell und ermöglicht die gleichzeitige Herstellung und Prüfung vieler verschiedener Konstrukte ohne übermäßigen Arbeitsaufwand. Falls gewünscht, kann rAAV6 unter Verwendung etablierter Protokolle wie der Iodixanol-Gradienten-Ultrazentrifugation34 oder der wässrigen Zweiphasenpartitionierung35 vor dem Pufferaustausch und der Konzentration weiter gereinigt werden.
Obwohl es die Gesamtausbeute verringerte, entschieden wir uns dafür, nur serumreduziertes Zellkulturmedium für die rAAV6-Aufreinigung anstelle der Aufreinigung aus dem Zellpellet zu verwenden, da der Großteil von rAAV6 in das Medium36 freigesetzt wird und die Reinigung aus dem Zellpellet mehr Kosten und Arbeit verursacht. Die Verwendung des selbstinaktivierenden adenoviralen Helfers erhöhte die Ausbeute im Durchschnitt um das 30- bis 40-fache und ermöglichte das Testen von in AAV6 verpackten Konstrukten in einer einzigen 15-cm-Schale. Obwohl unsere Aufreinigungsmethode einfach ist, erhalten wir mit dieser Methode eine relativ geringe Variation der Gen-Editing-Effizienz oder der Zelllebensfähigkeit nach der Transduktion unter Verwendung verschiedener Zelllinien oder anderer Primärzellen (Daten nicht gezeigt).
Wir haben ein Rhesusaffen-B-Zell-Reinigungsprotokoll entwickelt, um unberührte primäre B-Zellen unter Verwendung der negativen Depletion unerwünschter Populationen zu erhalten. Obwohl es für die Genom-Editierung dieser Zellen nicht notwendig ist, bietet es eine Möglichkeit, eine relativ reine Population von primären Rhesusaffen-B-Zellen für diese oder andere Anwendungen zu erhalten, falls andere Zelltypen die experimentellen Ziele stören. Die Reinheit geht jedoch auf Kosten einer verringerten Gesamtausbeute an B-Zellen. Bemerkenswert ist, dass sowohl für die angereicherten als auch für die nicht angereicherten B-Zellkulturen der Anteil der B-Zellen in den ursprünglichen PBMC- oder Splenozytenpräparaten entscheidend ist. Insbesondere für PBMCs empfehlen wir, verschiedene Makaken auf Individuen mit einem hohen Anteil an B-Zellen im peripheren Blut zu untersuchen, um eine hohe Anzahl von B-Zellen für Experimente zu erhalten, da dieser Wert zwischen Individuen dramatisch variieren kann27. PBMCs können durch regelmäßige Blutungen oder Leukapherese erhalten werden42.
Das Gen-Editing-Protokoll führt zu einer effizienten Gen-Editierung, typischerweise zwischen 60 % und 80 % der Knock-in-B-Zellen und 5 % -20 % der Knock-in-B-Zellen, obwohl wir bis zu 90 % BCR-Knock-out und 40 % BCR-Knock-in-B-Zellen erreicht haben (Abbildung 5 und Abbildung 6).
Die wichtigsten Parameter für die effiziente Bearbeitung von Rhesusaffen-B-Zellen sind die Schneideeffizienz der sgRNA, die Elektroporationsparameter, der MOI und die Qualität der rAAV6-Präparation. Die Schneideeffizienz von Kandidaten-sgRNAs sollte empirisch bestimmt werden, um eine optimale Bearbeitung und Gestaltung des HDRT zu ermöglichen. Die hier vorgestellten Elektroporationsparameter balancieren Effizienz und Viabilität aus, um die maximale Gesamtzahl der editierten B-Zellen und nicht den höchsten Prozentsatz der editierten B-Zellen zu erhalten. Wenn ein höherer Prozentsatz an bearbeiteten Zellen erforderlich ist, werden erhöhte Spannungen (bis zu 1.750 V) oder veränderte Pulslängen (10-30 ms) empfohlen, obwohl mehr Zelltod beobachtet werden kann. Wir stellten auch eine etwas höhere Bearbeitungseffizienz in Milz-B-Zellen im Vergleich zu B-Zellen aus PBMCs desselben Individuums fest (Abbildung 5); Der zugrunde liegende Grund dafür ist jedoch derzeit nicht bekannt.
Wir fanden heraus, dass die Zugabe von 1% DMSO nach der Elektroporation die Gen-Editing-Effizienz in Rhesusaffen-B-Zellen signifikant um ~40% erhöhte, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen (Abbildung 6A-C), in Übereinstimmung mit Berichten in anderen Zellen43. Eine verlängerte Kultur in 1% DMSO sollte jedoch vermieden werden und kann die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen. DMSO kann auf Wunsch komplett weggelassen werden.
Die Kultivierung der Zellen in einem kleinen Volumen nach mehrstündiger Elektroporation zusammen mit dem rAAV6 führt zu höheren Editiereffizienzen, wahrscheinlich aufgrund der besseren Transduktion von HDRT durch das rAAV6 und damit der höheren intrazellulären Konzentration von HDRT zum relevanten Zeitpunkt, wenn Cas9 aktiv ist. Wir fanden heraus, dass die Kultivierung der Zellen auf diese Weise für bis zu 8 Stunden die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigte, aber die Bearbeitungseffizienz stieg nicht dramatisch über 5 Stunden hinaus (Abbildung 6). Wenn nur Knock-out statt Knock-In erforderlich ist, kann dieser Schritt entfallen.
Abschließend stellen wir umfassende Protokolle für die Gen-Editierung von Rhesusaffen-B-Zellen in vitro und die Produktion von rAAV6 HDRT vor, die für das effiziente Einklopfen gewünschter Konstrukte erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die schnelle und kostengünstige Prüfung vieler Konstrukte, die als rAAV6 verpackt sind, und ermöglichen die präklinische Prüfung der Machbarkeit und Skalierbarkeit von B-Zelltherapien in einem relevanteren nicht-menschlichen Primatenmodell.

B-Zellen sind die Grundlage der humoralen Immunität. Bei Aktivierung durch verwandte Antigen- und Sekundärsignale entstehen aus naiven B-Zellen des Keimzentrums B-Zellen, Gedächtnis-B-Zellen und Plasmazellen1. Letzteres ist die Quelle der sezernierten Antikörper, die die Schutzfunktionen der meisten derzeit verfügbaren Impfstoffe vermitteln2. Plasmazellen wurden als Antikörperfabriken beschrieben, da sie große Mengen an Antikörpern in das Serum sezernieren - etwa 2 ng / Tag / Zelle3, was 7-16 g / l Serum entspricht, was Antikörper zu einem der drei am häufigsten vorkommenden Proteine im Serum4 macht. B-Zellen sind reichlich im Blut vorhanden und können daher leicht gewonnen und in ein Individuum zurückgegossen werden.
Diese Merkmale haben B-Zellen zu einem Ziel von Zelltherapiebemühungen gemacht, um den B-Zell-Rezeptor (BCR) zu geneditieren und breit neutralisierende Antikörper (bNAbs) gegen das humane Immundefizienzvirus (HIV)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 und andere Proteine zu exprimieren 16, 17,18,19,20,21. Solche Ansätze haben in zahlreichen Mausstudien in vivoPotenzial gezeigt 7,8,10,11,16,22. Für die klinische Translation 9,15,23 müssen jedoch noch einige Hürden überwunden werden, darunter Sicherheit, Dauer und Ausmaß der therapeutischen Wirksamkeit sowie die Skalierung auf größere Tiere wie nichtmenschliche Primaten (NHPs). In der Tat sind NHPs und insbesondere Rhesusaffen, die eine lange Geschichte in der Antikörper- und HIV-Forschunghaben 24,25, das am besten geeignete Modell, um diese Parameter zu testen.
Hier haben wir Protokolle entwickelt, die es ermöglichen, diese Probleme anzugehen. Bisher haben nur wenige Studien versucht, Rhesusaffen-B-Zellen ex vivo zu kultivieren, und nur eine positive Selektion unter Verwendung von CD20 wurde für die Reinigung von Rhesusaffen-B-Zellenberichtet 26,27,28. Wir haben ein Protokoll für die Isolierung von unberührten Rhesusaffen-B-Zellen durch die negative Depletion anderer Zelltypen erstellt. Darüber hinaus werden Kultivierungsbedingungen für die gezielte Genom-Editierung von Rhesusaffen-B-Zellen definiert. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von CRISPR/Cas9-Ribonukleoproteinen (RNPs) und rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus-Serotyp 6 (rAAV6) als homologiegesteuerte Reparaturvorlage (HDRT) zur Gen-Editierung kultivierter Rhesusaffen-B-Zellen. Mit diesem Protokoll wurden Bearbeitungseffizienzen von bis zu 40 % bei großen (~1,5 kb) Einfügungen erreicht. Wir stellen auch eine schnelle und kostengünstige Methode zur Herstellung von rAAV6 unter Verwendung eines Tetracyclin-fähigen, selbststummschaltenden adenoviralen Helfers29 vor, um die schnelle Testung von HDRTs in diesem Format zu ermöglichen. Zusammengenommen beschreiben diese Protokolle einen effizienten Arbeitsablauf für die Genom-Editierung von Rhesusaffen-B-Zellen (Abbildung 1), der die Bewertung von B-Zell-Therapien in einem NHP-Modell ermöglicht.
Um die Experimente zu starten, kann Spendermaterial aus kommerziellen Quellen bestellt oder durch Phlebotomie oder Splenektomie gewonnen werden. In dieser Studie wurden die Phlebotomien und Blutentnahmen wie zuvor beschrieben30 mit dem Gerinnungshemmer EDTA durchgeführt. Um Milz-, primäre Rhesusaffen-B-Zellen zu erhalten, wurden partielle (25%-50%) oder totale Splenektomien unter Verwendung von Techniken durchgeführt, über die zuvor berichtet wurde31. Die Tiere wurden vor der Operation über Nacht gefastet. Kurz gesagt, während der Operation wurde der Bauch abgeschnitten und dreimal abwechselnd mit Chlorhexidin und 70% Isopropylalkohol präpariert. Ein Schnitt (5-10 cm) wurde im Bauch gemacht, um die Milz zu identifizieren und zu isolieren. Das Gefäßsystem der Milz wurde entweder mit Nähten oder Gefäßklammern ligiert. Der Schnitt wurde in zwei Schichten mit 4-0 PDS-Polydioxanon-Nähten verschlossen. Die Splenektomie wurde einmalig für ein einzelnes Tier durchgeführt. Einzellige Suspensionen wurden aus Makakenmilz durch Mazeration durch Zellsiebe hergestellt. Mononukleäre Zellen aus Blut und Milzzellsuspensionen wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation hergestellt und in flüssigem Stickstoff gelagert.

<table><tbody><tr><td>1,5-ml-Röhrchen steril, Dnase-, RNASE- und Purogen-frei</td><td>Stellar Scientific</td><td>T17-125</td><td>oder ähnliche</td></tr><tr><td>serologische 10-ml-Pipette, Polystyrol, steril, pyrogen, DNase-/RNase-frei und frei von humaner DNA</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>15 cm Gewebekulturschale</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>15 mL konischer Tybe</td><td>aus Polypropylen Falcon</td><td>352097</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>25 mL serologische Pipette, Polystyrol, steril, nichtpyrogen, DNase-/RNase-frei und humane DNA frei</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>250 mL konischer Polypropylen-Tybe</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>oder ähnliche</td></tr><tr><td>293AAV-Zelllinie</td><td>Cell Biolabs</td><td>AAV-100</td><td></td></tr><tr><td>2-B-Mercapto-Ethanol, 55 mM (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>48-Well-Gewebekultur Platte</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>oder ähnliche</td></tr><tr><td>5 mL serologische Pipette, Polystyrol, steril, nicht pyrogen, DNase-/RNasefrei und Human-DNA-frei</td><td>Corning</td><td>4487</td><td>oder ähnliche</td></tr><tr><td>5 mL Spritzen mit Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>309646</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>50 mL Polypropylen konisch Tybe</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Serologische 50-ml-Pipette aus Polystyrol, steril, pyrogen, DNase-/RNase-frei und frei von humaner DNA</td><td>Corning</td><td>4490</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>oder ähnliches</td></tr><tr><td>AAV-6-Verpackungssystem (Plasmide)</td><td>Cell Biolabs</td><td>VPK-406</td><td></td></tr><tr><td>AAV6-Referenzmaterialien (vollständige Kapside)</td><td>Charles River</td><td>RS-AAV6-FL</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet S Pipettierhilfe</td><td>Marke</td><td>26350</td><td>oder ähnlich Pipettierhilfe</td></tr><tr><td>Antibiotikum/Antimykotikum 100x</td><td>Gibco</td><td>15260-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD14 AlexaFluor647</td><td>Biolegend</td><td>301812</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD14-Biotin</td><td>BioLegend</td><td>301826</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD16 AlexaFluor700</td><td>BD Biosciences</td><td>557920</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD16-Biotin</td><td>BioLegend</td><td>302004</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD20 PECy7</td><td>BioLegend</td><td>302312</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD3-Biotin</td><td>Thermo Fisher</td><td>APS0309</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD3 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552127</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD33-Biotin</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-347</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD64-Biotin</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>305004</tr><tr><td>Anti-Human-CD66-Biotin</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-143</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD89-Biotin</td><td>BioLegend</td> 354112 Anti-Human-CD8a-Biotin <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioLegend</td><td>301004</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-HLA-DR BV605</td><td>BioLegend</td><td>307640</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-Ig-Leichtkette Lambda APC</td><td>BioLegend</td><td>316610</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-IgM BV421</td><td>Biolegend</td><td>314516</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-Kappa-Leichtkette FITC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab 250</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Zellkultur-CO2-Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>51026331</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Zentrifugalfiltereinheit (Amicon Ultra - 4, 100 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5920 R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>oder eine andere, kühlbare schwingende Schaufelzentrifuge mit Einsätzen für 96-Well-Platten, Röhrchen der Größen 15, 50 und 250 mL</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Cpg ODN</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-2395</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI (RNase-frei)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationskit (Neon Transfection System 10 & micro; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td>oder andere Größen oder 100 μl Transfektionskit MPK 10096</td></tr><tr><td>Elektroporationssystem (Neon-Transfektionssystem)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03 *</td><td></td></tr> <tr><td>Ficoll-PM400 (Ficoll-Paque PLUS)</td><td>Cytiva</td><td>17144002</td><td>oder ähnliche</td></tr><tr><td>Abzugshaube</td><td>Fisher Scientific</td><td>FH3943810244</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Glutamin 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Messzylinder 1L</td><td>Corning</td><td>3022-1L</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z375357-1EA</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte Magnetrührer</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88857200</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Human BAFF</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>310-13</td><td></td></tr><tr><td>Mensch BD Fc Block</td><td>BD</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>Mensch IL-10</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophile Polyethersulfon-Spritzenvorsatzfilter, (Supor Membran), steril - 0,2 & Mikro; m, 25 mm&nbsp;</td><td>Pall</td><td>4612</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferin-Selen, 100x</td><td>Gibco</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>ITR-Primer vorne: GGAACCCCTAGTGATGGAGTT</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>kundenspezifischer</td><td></td></tr><tr><td>ITR-Primer auf der Rückseite: CGGCCTCAGTGAGCGA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>kundenspezifischer</td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Biosicherheitsschrank</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Große Säule mit magnetischer Verarmung (LD)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Magentischer Trenner (MidiMACS-Separator und Multiständer)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-329</td><td></td></tr><tr><td>Magnetischer Rührstab</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-127</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Magnetische Streptavidin-Kügelchen (Streptavidin MicroBeads)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep-Kit</td><td>Machery-Nagel</td><td>740414.5</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Medienflaschen 2L mit Verschluss</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34514-26</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>MegaCD40L Enzo</td><td></td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optische 384-Well-Reaktionsplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optischer Klebefilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td>oder eine andere Tischzentrifuge für 1,5 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>Mikrowellenherd</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD987SA</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Nikon TMS Inverses Phasenkontrastmikroskop</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>oder ein anderes inverses Phasenkontrastmikroskop für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren, 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreier Duplex-Puffer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Qiagen</td><td>129115</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Mettler Toledo</td><td>30019028</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Pipetman Classic Starter Kit, 4 Pipetten-Kit, P2, P20, P200, P1000 und Spitzen</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td>oder ähnliches Set Pipetten und Spitzen</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 10 %</td><td>Gibco</td><td>24040-032</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol 8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin, linear, MW 25000, Transfektionsqualität (PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-100</td><td></td></tr><tr><td>Präzisionswaage</td><td>Mettler Toledo</td><td>ME4001TE</td><td>oder ähnliche</td></tr><tr><td>Vorabscheidefilter (30 & Mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex-Becherglas 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34502-13</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Pyrex-Glasbecher 250 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS1000250</td><td>oder ähnliches</td></tr><tr><td>qPCR-Instrument Fisher</td><td>Scientific</td> 4485691 <td>oder ähnliches</td><td></td></tr><tr><td>RC1-Antigen zufällig biotinyliert</td><td>Björkman-Labor, CalTech</td><td>im Haus</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>S.p. Cas9 Nuclease</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081059</td><td></td></tr><tr><td>Scientific 1203 Wasserbad</td><td>VWR</td><td>24118</td><td>oder ein beliebiges Wasserbad mit 37 > C</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Einweg-Filtereinheiten mit PES-Membranen</td><td>Thermo&nbsp; Wissenschaftliches Nalgene&nbsp;</td><td>567-0020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin-fähiger, selbststummschaltender adenoviraler Vektor RepCap6&nbsp;</td><td>Oxgene</td><td>TESSA-RepCap6</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4</td>%<td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Wasseraufbereitungssystem</td><td>Millipore Sigma ZEQ7000TR</td><td></td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Zombie-NIR</td><td>Biolegend</td><td>423106</td><td></td></tr></tbody></table>

gen-editierung von primären rhesusaffen-b-zellen

Gene Editing of Primary Rhesus Macaque B Cells

B-Zellen und ihre Nachkommen sind die Quellen hochexprimierter Antikörper. Ihre hohen Proteinexpressionsfähigkeiten zusammen mit ihrer Häufigkeit, der leichten Zugänglichkeit über peripheres Blut und der Zugänglichkeit für einfache adoptive Transfers haben sie zu einem attraktiven Ziel für Gen-Editing-Ansätze gemacht, um rekombinante Antikörper oder andere therapeutische Proteine zu exprimieren. Die Gen-Editierung von primären B-Zellen der Maus und des Menschen ist effizient, und Mausmodelle für In-vivo-Studien haben sich als vielversprechend erwiesen, aber die Machbarkeit und Skalierbarkeit für größere Tiermodelle wurde bisher nicht nachgewiesen. Wir haben daher ein Protokoll entwickelt, um primäre B-Zellen von Rhesusaffen in vitro zu editieren, um solche Studien zu ermöglichen. Wir berichten über Bedingungen für die In-vitro-Kultur und Gen-Editierung von primären Rhesusaffen-B-Zellen aus mononukleären Zellen oder Splenozyten des peripheren Blutes mit CRISPR/Cas9. Um die gezielte Integration von großen (<4,5 kb) Kassetten zu erreichen, wurde ein schnelles und effizientes Protokoll zur Herstellung des rekombinanten Adeno-assoziierten Virus-Serotyps 6 als homologiegesteuerte Reparaturvorlage unter Verwendung eines Tetracyclin-fähigen, selbststummschaltenden adenoviralen Helfervektors aufgenommen. Diese Protokolle ermöglichen die Untersuchung prospektiver B-Zell-Therapeutika bei Rhesusaffen.

Wir stellen eine Methode zur Kultivierung und Gen-Editierung von primären Rhesusaffen-B-Zellen unter Verwendung von CRISPR/Cas9 und rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus-Serotyp 6 für die Untersuchung von B-Zell-Therapien vor.

Gen-Editierung von primären Rhesusaffen-B-Zellen

B cells and their progeny are the sources of highly expressed antibodies. Their high protein expression capabilities together with their abundance, easy ...

Die Methode ist relativ einfach und ermöglicht eine effiziente Gen-Editierung von Rhesusaffen-B-Zellen. Die Methode ermöglicht die Testung von geneditierten B-Zellen zu therapeutischen Zwecken bei Rhesusaffen. Es eignet sich auch für die präklinische B-Zelltherapie-Forschung.Das allgemeine Verfahren kann für andere Zelltypen angepasst werden. Wenn das Verfahren korrekt befolgt wird, sollte man keine Kämpfe erwarten. Da jedoch die gRNA-Schneideeffizienz und eine qualitativ hochwertige Charge einer rekombinanten AAV6-liefernden Vorlage von entscheidender Bedeutung sind.Zunächst werden die B-Zellkulturmedien in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad vorgewärmt. Tauen Sie die B-Zell-Stimulanzien auf Eis auf. Bereiten Sie ein Röhrchen mit geeigneter Größe vor, das ein vorgewärmtes Auftaumedium enthält.Tauen Sie ein bis zwei Fläschchen mit primären Rhesusaffen-Splenozyten oder PBMCs in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad auf. Die Splenozyten werden in das vorbereitete Röhrchen mit einem vorgewärmten Auftaumedium dekantiert. Spülen Sie die Kryoröhren, um alle Zellen zu sammeln.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen zum Waschen in 10 Milliliter Auftaumedium. Wiederholen Sie die Zentrifugationen dreimal, um das Gefriermedium zu entfernen.Nach der letzten Zentrifugation resuspendieren die Zellen schätzungsweise fünf mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in einem B-Zellkulturmedium. Kombinieren Sie 10 Mikroliter Zellsuspension mit 10 Mikrolitern 0,4% Trypanblau und zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer. Stellen Sie die Zellkonzentration auf dreimal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter mit B-Zellkulturmedium entsprechend der Zellzahl ein.Fügen Sie dann die B-Zell-Stimulanzien zu ihren endgültigen Konzentrationen hinzu und mischen Sie. Die Zellen werden in eine Zellkulturschale gegeben und bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid 48 Stunden lang inkubiert. Nach dem Absetzen sollten die Zellen eine dichte Monoschicht bilden und kleine Zellhaufen können bereits sichtbar sein.Nach etwa zwei Tagen sollten die Zellen gesund und unregelmäßig sein und sichtbar größere Cluster gebildet haben. Bereiten Sie nach der Aktivierung der B-Zellen die Reagenzien für die Elektroporation und Transduktion vor. DMSO-Nuklease-freier Duplexpuffer, Puffer T und Puffer E oder E2 aus dem Elektroporationskit auf Raumtemperatur vorwärmen.Tauen Sie die rAAV6-Homologie-gerichtete Reparaturschablone (HDRT) und die B-Zell-Stimulanzien auf Eis auf. Resuspendieren Sie die CRISPR-Cas9-Single-Guide-RNA oder sgRNA bei 100 Mikromolaren im Duplexpuffer. 10 Minuten bei Raumtemperatur rekonstituieren und durch Vortexen und Schnippen mischen.Legen Sie die rekonstituierte sgRNA bis zur Verwendung auf Eis. Bereiten Sie für die 10-Mikroliter-Elektroporation 550 Mikroliter B-Zellkulturmedium mit Stimulanzien und 1% DMSO vor. Geben Sie 50 Mikroliter dieses Mediums mit oder ohne Antibiotika in eine 48-Well-Zellkulturplatte.Fügen Sie dann dem Medium in den Vertiefungen rAAV6 HDRT hinzu, bis zu 20% des Volumens des Vertiefungs. Das zubereitete Gericht und das restliche Medium in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlensäure vorwärmen. Als nächstes bereiten Sie für die 10-Mikroliter-Elektroporation 1,15 Mikroliter Ribonukleoprotein oder RNP vor, indem 0,4 Mikroliter 61-mikromolares Cas9 mit 0,75 Mikrolitern 100-mikromolarer sgRNA in Duplexpuffer gemischt werden.Inkubieren Sie das RNP 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie es mit den Zellen mischen. Nach der Inkubation können mehrere RNPs kombiniert werden, wenn mehr als ein Locus gleichzeitig anvisiert werden soll. Als nächstes bereiten Sie die Zellen für die Elektroporation vor.Lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur, um Temperaturschocks zu vermeiden. Ernten Sie die Zellen nach der Inkubation in ein geeignetes Gefäß. Spülen Sie die Schale mit DPBS aus, um die maximale Anzahl von Zellen zu sammeln.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 G für 10 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in DPBS mit etwa zwei mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter, basierend auf der Anzahl der Zellen, die in die Kultur gegeben werden. Kombinieren Sie gleiche Volumina Zellsuspension und 0,4% Trypanblau und zählen Sie mit einem Hämozytometer.Nachdem Sie den Überstand zentrifugiert und verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen in vorgewärmtem Puffer T mit 5,55 mal 10 auf die sieben Zellen pro Milliliter, basierend auf der Zellzahl. Richten Sie das Transfektionssystem ein, indem Sie das Gerät einschalten und auf 1.350 Volt, 15 Millisekunden und einen Impuls einstellen. Platzieren Sie die Pipettenstation in der Laminar-Flow-Haube.Bereiten Sie für jeden Satz von 10 Elektroporationen ein Transfektionsröhrchen mit drei Millilitern Puffer E vor.Führen Sie das Röhrchen in die Pipettenstation ein. Kombinieren Sie 1,15 Mikroliter RNP mit neun Mikrolitern Zellen pro Elektroporation. Bereiten Sie mindestens 20% mehr vor, um Blasen zu vermeiden, und inkubieren Sie vor der Elektroporation eine Minute lang bei Raumtemperatur.Saugen Sie 10 Mikroliter RNP und Zellmischung in die Elektroporationsspitze einer Elektroporationspipette ein. Setzen Sie die geladene Pipette in die Pipettenstation ein und starten Sie die Elektroporation. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen vollständig frei von Luftblasen sind, um Lichtbögen zu vermeiden.Werfen Sie die elektroporierten Zellen sofort in das vorbereitete vorgewärmte kleine Volumen des Mediums, mit oder ohne rAAV6, innerhalb der 48-Well-Vertiefung aus. Kontrollproben ohne Transfektion in die Kulturvertiefungen geben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für vier bis sechs Stunden.Am Ende der Inkubation geben Sie 450 Mikroliter vorgewärmtes B-Zellkulturmedium, das Stimulanzien, DMSO und mit oder ohne Antibiotika enthält, in die Platte. Führen Sie nach 24 Stunden eine genomische DNA-Analyse durch. Quantifizieren Sie die Bearbeitungseffizienz mit der digitalen Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines Primers außerhalb des Homologiearms und eines Primers innerhalb des Inserts.Führen Sie eine PCR durch, um die Insertionsstelle zu amplifizieren, und eine Sanger-Sequenzierung, um die korrekte Bearbeitung zu überprüfen. Um die Proteingehalte zu analysieren, kultivieren Sie die Zellen 40 bis 48 Stunden nach der Elektroporation, um Änderungen der Proteinexpression zu ermöglichen, und führen Sie eine Analyse mittels Durchflusszytometrie durch. Die Produktion von rAAV6 unter Verwendung eines Tetracyclin-fähigen, selbststummschaltenden adenoviralen Helfers führte zu einer Produktion von viermal 10 bis 10 GC pro Milliliter Zellkulturmedium und übertraf damit die Produktion mit einer helferfreien Dreifachtransfektion um das 30- bis 40-fache.Die optionale Aufreinigung führte zur Eliminierung der Mehrheit der CD3+T-Zellen und CD14+- und CD16+myeloischen Zellen, wobei routinemäßig Reinheiten von 80 bis 95% CD20+B-Zellen erhalten wurden. Die Gen-Editierung von primären Rhesusaffen-B-Zellen wird hier gezeigt. Diese Studie behielt eine hohe Zellviabilität bei, während gleichzeitig die Leichtkettenexpression in 80% B-Zellen gelöscht wurde.Die Mehrzahl der B-Zellen exprimierte immer noch den Isotyp IgM. Die Zugabe von rAAV6, das für den Antikörper 1485 HDRT kodiert, führte in 16 bis 21% der B-Zellen zu Gen-Editierung und Antikörper-1485-Oberflächenexpression, wenn auch mit einer geringeren Fluoreszenzintensität für Antikörperketten als für uneditierte B-Zellen. Die Zugabe von 1% DMSO und ausgedehnte, konzentrierte Inkubationen mit dem rAAV6 HDRT erhöhten im Allgemeinen die Bearbeitungseffizienz.Mit dieser Methode wurden typischerweise fünf bis 20 % und bis zu 40 % Bearbeitungseffizienz erreicht, abhängig vom einzelnen Rhesusaffen und der Qualität der rAAV6-HDRT-Charge. Stellen Sie während der Elektroporation sicher, dass genügend Mischung für die Transfektion vorhanden ist und sich keine Blasen in der Spitze befinden. Die Zellen können mit jeder gewünschten Methode analysiert oder ein autologer Transfer in den Spender-Rhesusaffen durchgeführt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Immunologie und Infektion

Wir demonstrieren den Nutzen des multicolor Durchflusszytometrie für detaillierte phänotypische und funktionelle Charakterisierung von insgesamt sowie Speicherprodukte Teilmengen von CD4 + und CD8 + T-Zellen in Rhesusaffen, das ideale Modell für HIV / AIDS-Impfstoff-Studien.

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Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für das Aufzählen und Rhesusaffe CD8 + T - Zellen gegen das AIDS - Virus zu charakterisieren. Dieser Artikel ist nützlich , nicht nur auf dem Gebiet der HIV Immunologie, sondern auch auf anderen Bereichen der biomedizinischen Forschung , wo CD8 + T - Zell - Reaktionen bekannt sind , Krankheitsverlauf zu beeinflussen.

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Unter Verwendung einer vormontierten Cas9 ist Ribonucleoprotein Komplex (RNP) eine leistungsfähige Methode für präzise und effiziente Genom-Bearbeitung. Hier heben wir ihre Nützlichkeit in einem breiten Spektrum von Zellen und Organismen, einschließlich der primären humanen Zellen und sowohl klassische und neue Modellorganismen.

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Ziel dieses Protokolls ist es, nichtmenschlichen Primaten CD34 isolieren+ Zellen aus grundiert Knochenmark, um diese Zellen mit Lentivirale Vektoren gen zu modifizieren und ein Produkt zur Infusion in die autologe Host vorzubereiten. Die Gesamt-Protokoll-Länge ist ca. 48 h.

Vorbereitung und gentechnische Veränderung von Nichtmenschen Primas hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen

Hier wird ein Protokoll zur effizienten CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelten Genbearbeitung in Säugetierzellen mittels Röhrenelektroporation vorgestellt.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelte präzise Genbearbeitung durch Tube Electroporation

Wir skizzieren ein 9-Tage-Protokoll für die Transduktion und Expansion von rhesus-makaken peripheren Mononuklezellen im Blut, das Zellen mit hervorragender Koexpression der Gene von Interesse in ausreichender Anzahl für Infusionsstudien zur Zellwirksamkeit ergibt.

Transduktion und Erweiterung von primären T-Zellen in neun Tagen mit Erhaltung des Zentralen Speicherphänotyps

Hier stellen wir ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die CRISPR/Cas9-basierte Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen für Gen Knockout (KO) und Knock-in (KI) zur Untersuchung der biologischen Funktionen von Genen in B-Zellen und der Entwicklung von B-Zell-Therapeutika zur Verfügung.

Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen mit CRISPR/Cas9

Ziel dieses Protokolls ist es, eine nahtlose CRISPR/Cas9-Bearbeitung des C. elegans-Genoms unter Verwendung von zusammengesetzten Ribonukleoproteinkomplexen und dem dpy-10-Co-CRISPR-Marker für das Screening zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von genetischen Modifikationen in C. elegans vorzunehmen, einschließlich Insertionen, Deletionen, Genersatz und Codon-Substitutionen.

CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Genom-Editierung in aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Makrophagen unter Verwendung von Cas9-sgRNA-Ribonukleoproteinkomplexen, die in vitro zusammengesetzt und durch Elektroporation verabreicht werden.

Hocheffiziente Genzerstörung in primären Makrophagen aus dem Knochenmark unter Verwendung elektroporierter Cas9-sgRNA-Komplexe

Die Abgabe von Genomeditoren als RNAs ist ein besonders wirkungsvolles Mittel zur Modifikation der Genome primärer Säugetierzellen und -zelllinien. Ziel dieses Protokolls ist es, Genom-Editoren als mRNA in primäre Säugetierzellen und -zelllinien zu liefern, gefolgt von gezielter Illumina-Sequenzierung und Analyse zur Quantifizierung der Editierergebnisse.

Genom-Editierung in primären Säugetierzellen mittels Elektroporation von Editor-RNA

Lernen Sie die effiziente Gen-Editierung primärer Rhesusaffen-B-Zellen mit CRISPR/Cas9 und rAAV6 für präklinische B-Zell-Therapieforschung. Diese Methode ermöglicht präzise genetische Modifikationen.

Gen-Editierung von primären Rhesusaffen-B-Zellen

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