Aufbereitung von gefrorenen nicht-menschlichen Primateninseln für die kombinierte Einzelkern-RNA-Sequenzierung und ATAC-Sequenzierung sowie Bulk-Metabolomik
November 8th, 2024
Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus gefrorenen nicht-menschlichen Primaten-Pankreasinseln für die Verwendung in der gleichzeitigen Einzelkern-RNA-Sequenzierung und ATAC-Sequenzierung unter Beibehaltung der zytosolischen Massenfraktion für metabolomische Analysen aus denselben Proben.
Wir verwenden ein hochtranslationales, nicht-humanes Primatenmodell, um zu untersuchen, wie die Ernährung der Mutter und der Medikamentenkonsum während der Schwangerschaft die Embryonalentwicklung und die postnatale Funktion der Pankreasinseln bei den Nachkommen beeinflussen. Entwicklungsbedingt programmierte Veränderungen könnten die Anfälligkeit für Krankheiten im späteren Leben verändern. Eine Herausforderung bei der Arbeit mit schwer zu beschaffenden Proben, wie z. B. denen von nicht-menschlichen Primaten, besteht darin, mehrere Fragen derselben Person effizient auszuwerten.
Leider kann es schwierig sein, gleichzeitig Informationen aus dem Metabolom und dem Genom zu extrahieren, da die Assay-Reagenzien beim zeitkritischen Abbau der zu quantifizierenden Moleküle inkompatibel sind. Unser Protokoll ermöglicht die Extrapolation der Metabolitenhäufigkeit, der Chromatinzugänglichkeit und der differentiellen Genexpression aus demselben Ausgangsmaterial. Dieser mehrschichtige Ansatz gibt Aufschluss darüber, wie der Stoffwechsel das Genom in Pankreasinseln verändern kann.
Überblick
Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus eingefrorenen pankreatischen Inselzellen von nicht-menschlichen Primaten für simultane RNA-Sequenzierung und ATAC-Sequenzierung. Es bewahrt auch die bulkzytosolische Fraktion für metabolische Analysen und ermöglicht so ein umfassendes Verständnis von metabolischen und genomischen Interaktionen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Metabolomics
Hintergrund
- Modelle mit nicht-menschlichen Primaten sind entscheidend für die Untersuchung menschlicher Krankheitsmechanismen.
- Mütterliche Ernährung und Medikation können die Entwicklung der pankreatischen Inselzellen beim Nachwuchs beeinflussen.
- Die simultane Analyse von Metabolom und Genom ist aufgrund der Probenverschlechterung herausfordernd.
- Diese Studie adressiert den Bedarf an effizienten mehrschichtigen Analysen aus begrenzten Proben.
Zweck der Studie
- Um die Auswirkungen mütterlicher Faktoren auf die embryonale Entwicklung der pankreatischen Inselzellen zu beurteilen.
- Um zu erforschen, wie metabolische Veränderungen die genomische Expression beeinflussen können.
- Um ein Protokoll zu entwickeln, das eine umfassende Analyse aus derselben Probe ermöglicht.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Zellkernen aus pankreatischen Inselzellen.
- Simultane RNA-Sequenzierung und ATAC-Sequenzierung.
- Erhaltung von zytosolischen Fraktionen für metabolische Studien.
- Mehrschichtige Analyse zur Beurteilung von Metabolitenabfluss und Genexpression.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung hochwertiger Zellkerne und zytosolischer Fraktionen.
- Erkenntnisse darüber, wie die mütterliche Ernährung die Funktion der pankreatischen Inselzellen beeinflusst.
- Nachgewiesene Machbarkeit simultaner genomischer und metabolischer Analysen.
- Aufgedeckte potenzielle Verbindungen zwischen Stoffwechsel und Genexpression in den Inselzellen.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll ermöglicht eine umfassende Analyse pankreatischer Inselzellen.
- Die Ergebnisse können zukünftige Studien zur Krankheitsanfälligkeit beeinflussen.
- Unterstreicht die Bedeutung mütterlicher Einflüsse auf die Gesundheit des Nachwuchses.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Integrating single-nucleus RNA-seq, ATAC-seq, and bulk metabolomics from frozen non-human primate islets addresses a critical bottleneck in multi-omic discovery using rare or precious samples. This approach enables comprehensive molecular profiling from limited material, supporting predictive confidence in early target validation and mechanistic de-risking. The protocol maximizes data yield per sample, informing risk-adjusted portfolio decisions in metabolic and developmental disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic and epigenetic mechanisms underlying cellular identity in disease-relevant systems.
- Supports functional target validation by linking metabolite abundance to gene expression and chromatin accessibility.
- Facilitates mechanistic de-risking by integrating multi-layered molecular data from the same biological source.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nuclei and cytosolic fractions for downstream high-throughput sequencing and metabolomics workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing batch effects across multi-cohort studies.
- Enables quantitative, multi-omic outputs for robust compound or perturbation evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular readouts with disease-relevant metabolic and epigenetic biomarkers in translational models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by leveraging non-human primate systems.
- Provides predictive insights into developmental programming and disease susceptibility mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery, target validation, and translational research by enabling multi-omic profiling from rare tissue samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on metabolic-epigenetic interactions in islet development.
- Screening: Delivers reproducible nuclei and metabolite preparations for scalable omics assays.
- Analytics: Provides quantitative gene expression, chromatin accessibility, and metabolite abundance data for comparative analyses.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant phenotypes in non-human primate models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for maximizing data extraction from limited or archival samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Standardizes multi-omic sample preparation and minimizes batch effects.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient use of rare samples.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of metabolic and developmental disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nuclei isolation, single-nucleus sequencing, and metabolomics workflows.
- Demands access to high-throughput sequencing and mass spectrometry infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to control for batch effects.
- Adaptable to other tissue types but may require protocol optimization for different sample matrices.
- Sample scarcity and degradation sensitivity impose practical limitations on throughput and timing.
