Nicht-invasive Quantifizierung der Skelettmuskulatur bei Kleintieren mittels Mikro-Computertomographie

Die microCT ist eine kostengünstige, nicht-invasive Technik zur Analyse der Körperzusammensetzung. Es ist vorteilhaft in muskelphysiologischen Studien, die bei Eingriffen möglich sind. microCT liefert mehrfach Daten desselben Tieres, verbessert die Analysequalität und reduziert den Tiereinsatz.

Photonenzählende Röntgendetektoren sind eine Innovation in der MikroCT, die die quantitative Differenzierung von Geweben unter Verwendung verschiedener Kontrastmittel ermöglicht, die mit Nanopartikelplattformen verbunden sind. Dadurch kann die Identifizierung verschiedener anatomischer Bereiche mit einer Bariumlösung verbessert werden. Das Training stellt eine große Herausforderung bei der Analyse von microCT-Daten dar, und auch das Fehlen konsistenter Protokolle für die präklinische CT kann die Bildaufnahme erschweren, insbesondere beim Umgang mit Biomaterialien oder Tumorbildern, da die anatomischen Regionen unterschiedliche Hounsfield-Werte aufweisen können.

Unser Protokoll bietet einen Schritt-für-Schritt-Pfad, der es geschulten und ungeschulten Benutzern ermöglicht, microCT-Datenerfassung und -analyse mit ähnlichen Ergebnissen durchzuführen. Wir konzentrieren uns nun auf die Analyse des spontanen Kompartiments von Mäusen, das mit der Skelettmuskelfunktion und der sozialen Interaktion verbunden ist. Wir sind auch daran interessiert, die Differenzierung von Skelettzellen in vitro mit 2D- und 3D-Modellen zu untersuchen.

Positionieren Sie zunächst die anästhesierte Maus in Rückenlage auf dem microCT-Scanner mit einem speziellen Mausbett. Sichern Sie die Maus mit einem Nasenkonus und Klebeband, um Bewegungen während des Scans zu minimieren. Setzen Sie dann die Maus in die Gantry des microCT-Scanners ein.

Erfassen Sie Körper-microCT-Scans mit einem hochauflösenden präklinischen Bildgebungssystem. Nehmen Sie insgesamt 1.024 Projektionen mit einer Belichtungszeit von jeweils 470 Millisekunden im Fly-Mode-Modus bei einer Spannung von 60 Kilovolt und einem Strom von 480 Mikroampere auf. Stellen Sie das System auf eine Vergrößerung von 1,25 ein, was zu einem Sichtfeld von 94,72 Millimetern für eine Gesamterfassungszeit von 8,02 Minuten führt.

Erfassen Sie Bilder mit einem Binning von eins nach dem anderen, was eine Auflösung von 2.368 x 2.240 Pixeln ergibt. Führen Sie einen Scan mit den gleichen Parametern an einem zylindrischen Phantom aus Acryl durch und extrahieren Sie Hounsfield-Einheiten- oder HU-Werte für Luft und Wasser mit der referenzierten Software. Konvertieren Sie die Bilder in DICOM-Dateien und korrigieren Sie die HU-Werte.

Nachdem Sie microCT-Bilder der Maus aufgenommen haben, öffnen Sie die Bildanalysesoftware und suchen Sie das 3D-Slicer-Menü im oberen linken Bereich der Benutzeroberfläche, das in einer graublauen Farbe hervorgehoben ist. Klicken Sie auf Daten hinzufügen. Wenn das Fenster mit zwei Optionen angezeigt wird, wählen Sie die erste Option aus und wählen Sie das hinzuzufügende Verzeichnis aus.

Navigieren Sie dann zu dem Ordner, der die DICOM-Zielbilder enthält, und klicken Sie darauf. Beobachten Sie die Bilder, die auf drei Bildschirmen angezeigt werden, die verschiedene anatomische Ebenen darstellen, koronal als grün, sagittal als gelb und quer wie rot. Wählen Sie auf der oberen Registerkarte unter Module den Segmenteditor aus, um die Segmentierungsoptionen zu öffnen.

Klicken Sie anschließend auf die grüne Plus-Schaltfläche Hinzufügen, um neue Segmente zu erstellen und den HU-Bereich für jeden Gewebetyp zu definieren. Doppelklicken Sie nun auf jedes Segment, um es entsprechend den gewünschten Einstellungen zu benennen und einzufärben. Legen Sie den HU-Bereich für jedes Segment mit der Schwellenwertfunktion fest.

Geben Sie für jeden Gewebetyp die HU-Werte ein, mageres Gewebe minus 29 bis 225, Fettgewebe minus 190 bis minus 30 und Knochen 500 bis 5.000. Klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen. Nachdem Sie die HU-Bereiche festgelegt haben, klicken Sie auf 3D anzeigen, um ein 3D-Rendering der segmentierten Gewebe zu erstellen.

Wählen Sie im Menü "Segmentierung" das Scherenwerkzeug aus, um unerwünschte Objekte zu entfernen. Klicken Sie bei anatomischen Ebenen auf die Schaltfläche "Ansicht maximieren" auf dem farbigen Balken der gewünschten Ebene und navigieren Sie mit der Maus durch den CT-Scan. Für das 3D-Rendering verwenden Sie die linke Maustaste zum Drehen und die rechte Maustaste zum Zoomen.

Verwenden Sie als Nächstes das Scherenwerkzeug, um das unerwünschte Objekt zu markieren und einzukreisen, um es aus dem Bild zu entfernen. Klicken Sie auf das Symbol für das Layout der Wiederherstellungsansicht, um zum Layout mit vier Fenstern zurückzukehren. Navigieren Sie nach der Segmentierung zu Quantifizierung und Segmentstatistiken, um die Volumina für jedes Segment zu berechnen.

Klicken Sie auf Übernehmen, und warten Sie, bis die Software eine Tabelle mit Werten für jede Segmentierung generiert hat, in der sowohl die Beschriftungskarte als auch die geschlossenen Oberflächenvolumina angezeigt werden. Verwenden Sie die von der Software bereitgestellten Volumenmaße in Kubikzentimetern, um diese Volumina in Gewebemasse umzurechnen. Wenden Sie für jeden Gewebetyp die entsprechende Dichte an, 0,95 Gramm pro Kubikzentimeter für Fettgewebe, 1,05 Gramm pro Kubikzentimeter für mageres Gewebe und 1,92 Gramm pro Kubikzentimeter für Skelettgewebe.

Kehren Sie für Knochenlängenmessungen zum Menü des Segmenteditors zurück und blenden Sie die Fett- und Magergewebesegmente aus, indem Sie auf das Augensymbol neben jedem Segment klicken. Wählen Sie als Nächstes die Symbolleistenoption in der oberen Ecke des Hauptmenüs. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Linie erstellen, um die Bone-Länge im 3D-Rendering zu messen.

Identifizieren Sie den Knochen in der 3D-Rekonstruktion. Klicken Sie auf ein Ende des Knochens und dann auf das andere Ende, damit die Software seine Länge messen kann. Die Segmentierung von Skelett-, Fett- und Magergewebe wurde durch sequentielle koronale, sagittale und transversale Ebenen dargestellt, was eine klare Gewebeunterscheidung zeigt.

3D-Renderings zeigten detaillierte anatomische Strukturen, wobei Blau für Knochen, Gelb für Fettgewebe und Rot für mageres Gewebe steht. Ältere Probanden zeigten im Vergleich zu erwachsenen Probanden einen höheren Körperfettanteil und eine reduzierte Muskelmasse, was altersbedingte Veränderungen in der Körperzusammensetzung verdeutlicht.