Name: Parallelisierter längs Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse von einem nackten Rattenmodell Osteoporose bedingte Wirbelfraktur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Erstellung eines Nacktrattenmodells für osteoporosebedingte Wirbelkompressionsfrakturen mit semiautomatisierter Mikro-CT-Analyse. Diese Methode ermöglicht präzise in-vivo-Evaluierung von Knochenregenerationstherapien.

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Die Forschung wurde durch einen Zuschuss aus dem California Institute für Regenerative Medizin (CIRM) (TR2-01780) unterstützt.

alle Tierversuche wurden unter einem Protokoll genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des Cedars-Sinai Medical Center (Protokoll Nr. 3609) durchgeführt. Anästhesie verabreicht wurde für alle bildgebenden und chirurgische Eingriffe. Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit genehmigten IACUC Protokolle untergebracht.
 Hinweis: das experimentelle Design dieses Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Kaufen Sie sechs Wochen alte Ratten mit ihren Eierstöcken chirurgisch entfernt und füttern eine LCD, bestehend aus Kalzium und 0,77 % Phosphat 0,01 %. Bohren Sie nach einem Zeitraum von 4 Monaten eine LCD-Anzeige einen kritische Größe Wirbelkörper Defekt in der vierten und fünften lumbalen Wirbelkörper (L4-L5). Nach der Operation wird Bild die Ratten an Tag 1 und 2, 4, 8 und 12 Wochen nach Gründung defekt. Finden Sie defekt Margen auf dem Tag 1 Scan, neu orientieren Sie, eine standard-Position und definieren Sie einem zylindrischen Volumen von Interesse (VOI) zu. Die nachfolgenden µCT Scans (d. h., für 2, 4, 8 und 12 Wochen) jede Ratte an der Standardposition definiert für den entsprechenden Tag 1 Scan automatisch zu registrieren. Wenden Sie den Tag 1 VOI an die eingetragene Scans vordefiniert. Beurteilung der Knochendichte Volumen und scheinbare Dichte der VOIs.
 1. Induktion von Osteoporose <ol><li>4 Monate eine LCD-Anzeige, bestehend aus 0,01 % Kalzium und 0,77 % Phosphat sechs Wochen alten Athymic ovariectomized Ratten anziehen.</li>
	<li>Schalter zurück zu einer normalen Ernährung. 
	Hinweis: Diese Ratten bezeichnet werden als &#34; osteoporotischen Ratten &#34; nachstehend.</li>
</ol> 2. Wirbelkörper defekt-Modell Hinweis: das Timing ist 40-50 min pro Tier.
<ol><li>Autoklav alle chirurgischen Instrumente vor der Operation.</li>
	<li>Bei mehreren Operationen, sterilisieren alle chirurgischen Werkzeuge.
	<ol><li>Der Werkzeuge zu waschen und legen Sie sie in einem Sonikator Bad für 5 min. Legen Sie sie in einem heißen Perle Sterilisator Set auf 250 ° C für 20 S. erlauben die Werkzeuge für 5 min. abkühlen lassen</li>
	</ol></li> <li>Induzieren Anästhesie.
	<ol><li>Ort befestigt die osteoporotische Ratte in der Induktion Kammer ein Anästhesiegerät mit einem zentralen scavenging-System. Anästhesie mit 5 % Isofluran in 100 % Sauerstoff zu induzieren und pflegen über Bugnase bei 2-3 % Isofluran. Tierarzt Salbe für die Augen verwenden, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.</li>
		<li>Gelten einen Zehe-Prise Anreiz für angemessene Ebene der Narkose zu gewährleisten. Wenn keine Antwort vermerkt ist, Einleitung des Verfahrens.</li>
	</ol></li> <li>Die narkotisierten Ratte in dorsal liegen auf ein Heizkissen (37 ° C) und Strecken die Gliedmaßen mit einem magnetischen Fixateur Rücknahme System ( Abbildung 2A). 
	Hinweis: Die Temperatur des Heizkissens ist wichtig zur Vermeidung von Hypothermie, da eine narkotisierten Ratte nicht in der Lage, ihre Körpertemperatur zu regulieren ist.</li>
	<li>Rasieren im Bauchbereich einen elektrischen Rasierer verwenden. Wischen Sie es mit Jod-basierten Antiseptikum und Chlorhexidin Gluconat 0,5 % gefolgt von 70 % igem Ethanol.</li>
	<li>Spritzen die Ratte mit Carprofen (5 mg/kg Körpergewicht (BW), subkutane (SQ)) vor Beginn des chirurgischen Verfahrens.</li>
	<li>Verwenden ein steriles Skalpell schneiden Sie die Haut. Den Schnitt 1 cm unter dem Xiphoid Prozeß zu beginnen und Durchtrennen der Mittellinie (~ 5-8 cm) ( Abb. 2 b).</li>
	<li>Chirurgische Scheren verwenden, um einen Schnitt von der Aponeurose durch die Linea Alba auf der Bauchhöhle ( Abbildung 2).</li>
	<li>Setzen die Bauchhöhle mit Retraktoren ( Abb. 2D).</li>
	<li>Lenken den Darm auf der rechten Seite der Ratte, der Bauchschlagader und die linke Niere ( Abb. 2E) aussetzen. Ertasten der Lendenwirbelsäule, bevor Sie fortfahren zu entlarven. Um Austrocknung zu vermeiden, verwenden Sie sterile getränkte Gazen mit steriler Kochsalzlösung, wickeln Sie die inneren Organe.</li>
	<li>Gebrauch Thermocautery zu entlarven in Schichten den vorderen Aspekt der lumbalen Wirbelkörper L4-5 und aus den umliegenden Bindegewebe und Muskulatur zu isolieren ( Abbildung 2F -G). 
	Hinweis: Thermocautery sollten verwendet werden, um Steuern, Blutungen während der Dissektion.</li>
	<li>Verwenden einen sterilen Wattetupfer gesättigt mit steriler Kochsalzlösung, um Blut und Restmüll Gewebe aus den Wirbeln L4 zu entfernen. Verwenden Sie eine sterile Trephine Bohrer Bohrer (~ 2 mm im Durchmesser), ein 5 mm tiefen Knochendefekt in der Mitte der exponierten vorderen Aspekt des Wirbelkörpers zu bohren (Abbildung 2 H-ich). 
	Hinweis: Minimal Druck durch nur dem ventralen Kortex und dem darunter liegenden trabekulären Knochen gebohrt; vermeiden Sie Bohren durch den dorsalen Cortex. Beachten Sie, dass die Wirbel von osteoporotischen Ratten sehr zerbrechlich sind. Verwenden Sie ein Wattestäbchen zum Reinigen des Mangels und Druck Blutstillung, falls vorhanden.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.11 auf der Wirbel L5 erstelle ich insgesamt 2 Fehler pro Ratte ( Abbildung 2J).</li>
	<li>Den Darm in den Bauchraum zurück.</li>
	<li>Verwenden eine Vicryl synthetische resorbierbare chirurgische Naht (3-0 Vicryl ungefärbt 27 &#34; SH Kegel) in einem kontinuierlichen Muster, Naht der Aponeurose ( Abbildung 2 K).</li>
	<li>In der Nähe der Haut mit einer 4: 0 Monofilament Nylon nicht resorbierbaren Naht in einem einfachen unterbrochene Muster ( Abbildung 2 L).</li>
	<li>Gelten 100 µL topische Hautkleber auf die Hautnähte und zwischen ihnen, die vollständige Schließung der Haut zu gewährleisten.</li>
	<li>Spritzen die Ratte mit Warm (37 ° C) gesäugt Ringer &#39; s Lösung (1CC/100 g BW, SQ), Unterkühlung und Austrocknung zu verhindern.</li>
	<li>Die Ratte mit Buprenorphin (0,5 mg/kg BW, SQ) vor der Operation und alle 8-12 h für postoperative Schmerzlinderung zu injizieren, je nach Bedarf.</li>
	<li>Das Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Auch nicht zurück, ein Tier, die Operation, um die Gesellschaft anderer Tiere durchlaufen hat, bis es vollständig erholt hat.</li>
	<li>Nachdem das Tier auf das Heizkissen erholt hat an seinem Käfig zurück. 
	Hinweis: Haus der Ratten einzeln (d. h. in getrennten Käfigen) zur Verhinderung von Ratte zu Ratte Verstümmelung der Nähte und Wunde.</li>
	<li>Legen Sie Chow eingeweicht in Wasser in einer Petrischale auf den Boden für ein paar Tage nach der Operation zu helfen, die Ratten, die das Essen zu erreichen.</li>
	<li>Carprofen (5 mg/kg BW, SQ) 24 h nach der Operation zur Schmerzlinderung alle 24 h nach Bedarf zu verwalten.</li>
	<li>Die Hautnähte zu entfernen, während das Tier unter 2 % Isofluran Anästhesie 10-14 Tage nach der Operation.</li>
</ol> 3. Diese Scannen Hinweis: das Timing ist 30-40 min pro Tier.
<ol><li>Am Tag nach dem chirurgischen Eingriff, legen die osteoporotische Ratte in der Induktion Kammer an einem Anästhesiegerät mit einem zentralen scavenging-System angeschlossen. Anästhesie mit 5 % Isofluran in 100 % Sauerstoff zu induzieren und pflegen über Bugnase bei 2-3 % Isofluran.</li>
	<li>Scannen die Ratte mit einem in Vivo µCT-Scanner. Wiederholen Sie die longitudinale Analyse der Knochenregeneration werden gesucht. 
	Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Tiere mit den gleichen Einstellungen (z.B. Röntgenenergie, Medium, Intensität, Voxel-Größe und Auflösung scannen) geprüft werden und in einen gleichwertigenR-Orientierung. Zum Beispiel: Röntgenenergie, 55 "KVP"; Strom, 145 µA; Voxel Größe, 35 µm; Schritten, 115 µm; und Integrationszeit, 200 ms; mit den Proben mit PBS-Puffer. Beziehen sich auf Bouxtein Et al. 34 weitere Erläuterungen und Überlegungen Nagetier µCT Scannen für eine Bewertung der Mikrostruktur der Knochen beteiligt. Idealerweise würde die höchste Scan-Auflösung für alle Scans verwendet werden; jedoch höher aufgelöste Scans erfordern längere Aufnahmezeiten, großen Datenmengen zu generieren und die Tiere mehr ionisierende Strahlung aussetzen. Letzteres kann unerwünschte Effekte, darunter verminderte Frakturheilung einführen. Daher sollte ein Kompromiss zwischen der Zusatzdaten und Scan-Zeit sorgfältig berücksichtigt werden.</li>
</ol> 4. Wirbelkörper Trennung Hinweis: das Timing ist 20-30 min pro Probe.
<ol><li>Kontur des Wirbels von Interesse, wie in Abbildung 3A-I. Stellen Sie sicher, alle Teile des Wirbels beim benachbarten Wirbeln gehörenden Teile ausschließen.
	<ol><li>Klicken Sie auf &#34; µCT-Bewertungsprogramm &#34; und wählen Sie das Beispiel aus dem Menü ".</li>
		<li>Contour jede Scheibe mit der Maus.</li>
		<li>Verwendung der &#34; Z &#34; Bar, bis zum nächsten Schnitt gehen.</li>
	</ol></li> <li>Geformten Wirbel als separate Datei zu speichern ( Abbildung 3J -K) durch Anklicken &#34; Datei &#34; &#8594; &#34; sparen GOBJ &#34; alle paar Scheiben.</li></ol>
 5. Definition des VOI für längs-Quantitative Auswertung Hinweis: die folgenden Schritte davon abhängen, ob der Scan vom 1. Tag nach der Operation (Referenz Wirbel) oder aus der späteren Zeit Punkte (ist Ziel der Wirbel).
<ol><li>Referenz Wirbel. 
	Hinweis: Das Timing ist 20-30 min pro Probe.
	<ol><li>Für Z-Rotation, messen den Winkel der Ränder mit einem XY-Scheibe aus der Mitte des Mangels ( Abbildung 4A -B).
		<ol><li>Auf der Z-Ebene, gehen in den Bereich des Wirbels, wo der Fehler den meisten klar und Bildschirm-Aufnahme ist, des Wirbels.</li>
			<li>In einer Präsentations-Software, bereiten Sie ein Rechteck-förmiges Objekt, das in den Defekt passt.</li>
			<li>Das Bild des Wirbels zu drehen, so dass der Defekt nach oben zeigt und die Gewinnmargen defekt sind parallel zu den Seiten des Rechtecks.</li>
			<li>Messen den Winkel der Drehung (mit der rechten Maustaste auf das Bild &#8594; &#34; Formatabbildung &#34; &#8594; &#34; Größe &#34;).</li>
			<li>Verwenden die gemessenen Winkel drehen des Wirbels ( Abbildung 4).
			<ol><li>Ein neues DECterm-Fenster öffnen (&#34; Sitzungs-Manager &#34; &#8594; &#34; Anwendungen &#34; &#8594; &#34; DECterm &#34;).</li>
				<li>Laufen &#34; Ipl &#34;:</li>
				<li>Ipl &#62; turn3d</li>
				<li>-Eingabe [in] &#62;</li>
				<li>-Ausgang [Out] &#62;</li>
				<li>-Turnaxis_angles [0,000 90,000 90.000] &#62; 90 90 0</li>
				<li>-Turnangle [0.000] &#62; gemessenen Winkel</li>
				<li>-Img_interpol_option [1] &#62;</li></ol>
			</li></ol></li> <li>Für X-Rotation, messen den Winkel der Ränder mit einem YZ-Scheibe aus der Mitte des Mangels ( Abbildung 4 -E). Verwenden des gemessenen Winkels des Wirbels ( Abb. 4F) drehen.
		<ol><li>Klicken Sie auf &#34; YZ &#34; in &#34; uCT Auswertungsprogramm &#34; und wiederholen Sie die Schritte 5.1.1.1-5.1.1.5.2.</li>
			<li>Ipl &#62; Isq</li>
			<li>-Aim_name [in] &#62;</li>
			<li>-Isq_filename [Default_file_name] &#62; Verzeichnis der ISQ einfügen (z. B. &#34; DK0: [MICROCT. DATEN. GAZIT. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. ISQ &#34;)</li> <li>-pos [0 0 0] &#62;</li> <li>-dim [-1-1-1] &#62;</li></ol></li> <li>Flip gedrehten Wirbel durch eine Änderung der XY-Ebene der ZX-Ebene.
		<ol><li>Ein neues DECterm-Fenster öffnen (&#34; Sitzungs-Manager &#34; &#8594; &#34; Anwendungen &#34; &#8594; &#34; DECterm &#34;).</li>
			<li>Laufen &#34; Ipl &#34;:</li>
			<li>Ipl &#62; flip-</li>
			<li>-Eingabe [in] &#62;,</li>
			<li>-Eingang [Out] &#62; out2</li>
			<li>-New_xydir [Yz] &#62; Zx</li></ol>
		</li> <li>VOI zu definieren.
		<ol><li>Draw Runde Kontur des Mangels mit einer Scheibe aus der Mitte des Mangels durch die Auswahl der Kontur Kreissymbol in &#34; uCT Auswertungsprogramm &#34; ( Abb. 6A). Kopie, Kontur und fügen Sie ihn auf allen Scheiben in den defekt ( Abb. 6 b). 
			Hinweis: Da alle Mängel, die nach dem gleichen Verfahren erstellt wurden, analysieren die gleiche Anzahl von Scheiben und anschließend das Gesamtvolumen (TV) für alle Proben.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Ziel Wirbel. 
	Hinweis: Das Timing ist 10-20 min pro Probe.
	<ol><li>Last der DICOM-Dateien des Ziels und die Referenz-Wirbel in das Hauptfenster der Bildanalyse-Software. 
		Hinweis: Ausgabe in Graustufen Wertänderungen zu vermeiden, definieren Sie die gleichen Datentyp wie die ursprünglichen DICOM-Dateien im Menü Last.</li>
		<li>Register zur Referenz Wirbel.
		<ol><li>Start der &#34; 3-d-Voxel-Registrierung &#34; Modul und geben Sie die Referenz-Wirbel als der &#34; Base Volumen &#34; und die Ziel-Wirbel als der &#34; Match Volumen. &#34; klicken Sie &#34; registrieren &#34; Wirbel zu registrieren ( Abbildung 5).</li>
		</ol></li> <li>Speichern die registrierte Datei mit die gleichen Daten geben und zu einer µCT-Umgebung zu importieren.</li>
		<li>Gelten die VOI.
		<ol><li>Übernehmen die VOI definiert für die Referenz Wirbel um die registrierten Ziel Wirbel durch Klicken auf &#34; uCT Auswertungsprogramm &#34; &#8594; &#34; Datei &#34; &#8594; &#34; Last GOBJ &#34; und wählen Sie die zuvor erstellte GOBJ. Überprüfen Sie, ob die VOI und mangels konzentrisch sind.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 6. MicroCT Analyse Hinweis: das Timing ist 10-20 min pro Probe.
<ol><li>Send VOI für Auswertung über einen µCT-Auswertungsprogramm ( Abbildung 6). 
	Hinweis: Stellen Sie sicher die gleichen Parameter verwenden, wenn alle VOIs zu analysieren. Stellen Sie sicher, den Schwellenwert ist hoch genug, um Hintergrundgeräusche mit minimalem Verlust an Knochenmasse zu vernachlässigen. Wenn röntgendichten Biomaterial verwendet wird, könnte eine Reihe von Strategien zum Analysieren der Knochenbildung. Wenn es einen Unterschied in der Dichte zwischen das Biomaterial und Knochen Gewebe gibt, konnte das Biomaterial, 35 , 36 segmentiert werden. Andernfalls könnte die Ermittler qualitativ bewerten die Unterschiede bei der Knochenbildung zwischen Versuchsgruppen.</li>
</ol> 7. Euthanasie <ol><li>PPlace die osteoporotische Ratte in der Induktion Kammer an eine Anästhesiegerät befestigt. Anästhesie mit 5 % Isofluran in 100 % Sauerstoff induzieren.</li>
	<li>Pflegen Anästhesie über Bugnase und Euthanasie ausführen durch Einritzen der Brusthöhle zur Herstellung einer bilateralen Pneumothorax 37.</li>
</ol>

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</ol>

Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss aus dem California Institute für Regenerative Medizin (CIRM) (TR2-01780) unterstützt.

Osteoporose ist die häufigste Ursache der vertebralen Kompressionsfrakturen, verursacht durch eine erhöhte Belastung auf die Wirbelsäule und dazu führen, dass der Zusammenbruch des Wirbelkörpers. Allerdings ist es praktisch unmöglich, eine Verletzung in einem Nagetier zu generieren, die einen ähnlichen Wirbelkörper Zusammenbruch authentisch repliziert. Stattdessen erstellen Forscher eine zylindrische leere in der Mitte des Wirbelkörpers, OVCFs16,17,<su...

Mehr als 200 Millionen Menschen weltweit leiden an Osteoporose1. Die zugrunde liegenden pathologischen Abnahme der Knochendichte (BMD) und veränderten Knochen Mikroarchitektur zu erhöhen, Knochenbrüchigkeit und infolgedessen das relative Risiko von Frakturen2. Osteoporose ist so weit verbreitet und schädlich für die Gesundheit die WHO eine große Gesundheitsproblem definiert hat. Darüber, wie die Weltbevölkerung Alter erwartet wird, Osteoporose dürfte sogar noch häufiger geworden.
Osteoporotische Wirbelkörper-Kompressionsfrakturen sind die häufigsten Zerbrechlichkeit Frakturen, schätzungsweise mehr als 750.000 pro Jahr in den USA. Sie sind verbunden mit erheblicher Morbidität und so viel wie ein neun-Mal höhere Sterblichkeit3. In klinischen Studien derzeit verfügbaren chirurgische Eingriffe, wie z. B. Vertebroplastie und Kyphoplastie, erwiesen sich nicht wirksamer als ein Schein Behandlung4,5, diese Patienten nur Schmerztherapie zur Verfügung überlassen. Da aktuelle OVCF Behandlungen begrenzt sind, ist es unerlässlich, ein Tiermodell zu entwickeln, die die Störung6,7,8replizieren kann. Solchen Tiermodellen konnte erleichtern, die Untersuchung der aktuellen Behandlungsmethoden und der Entwicklung neuartiger Therapien, die in die klinische Praxis umsetzen wird. Osteoporose wurde induziert und nachhaltig in Tiermodellen durch die Gabe einer niedrigen Kalzium Ernährung (LCD) in Verbindung mit Ovariectomy1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. um den Knochenverlust verbunden mit OVCFs weiter zu modellieren, Wirbelkörper Knochendefekte entstanden im osteoporotischen immunkompetenten Ratten 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. In dieser Arbeit wird ein Wirbelkörper defekt-Modell von immungeschwächten Ratten mit modellierten Osteoporose vorgestellt. Dieses neue Modell lässt sich beurteilen, zellbasierte Therapien mit Stammzellen aus verschiedenen Quellen und Arten für die Reparatur von anspruchsvollen Frakturen, wie z. B. OVCFs.
Knochen-Bildgebung ist ein wesentlicher Bestandteil der Bewertung von Frakturen und Knochenerkrankungen. Moderne bildgebende Verfahren wurden für die genaue Beurteilung der strukturellen Knochenveränderungen und Regeneration Strategien25entwickelt. Unter anderem entstanden µCT Bildgebung als eine nicht-invasive, einfach zu bedienende und kostengünstige Methode, die hochauflösende 3D Bilder liefert. µCT-Bildgebung hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Modalitäten bei der Bewertung von Osteoporose-Patienten, da es bietet hochauflösende 3D Knochen Mikroarchitektur26 , das anschließend quantitativ analysiert werden können. Letzteres kann dann verwendet werden, um die therapeutische Wirkung der vorgeschlagenen Behandlungen zu vergleichen. In der Tat ist in Vivo µCT-Bildgebung ein Goldstandard für die Regeneration der Wirbelsäule defekt Überwachung1,16,27. Jedoch haben einige Publikationen28,29,30,31 eingesetzt automatisierte Registrierung Tools Benutzer-Abhängigkeit, Interpolation Voreingenommenheit und Präzision Fehler der µCT zu minimieren Imaging-basierte Analyse. Vor kurzem waren wir die ersten ein Registrierungsverfahren zu verwenden, um die Analyse der Knochenregeneration in einen standardisierten nichtig, Knochen zu verbessern, wie in diesem Protokoll32 erläutert.
Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, um die Wirkung von neuartiger Zelltherapien für OVCFs zu untersuchen, ungehindert vom Host T-Zell-Reaktionen, die xenogene oder allogene Zellen ablehnen könnte. Osteoporose ist bei jungen Ratten durch Ovariectomy (OVX) und 4 Monaten ein LCD induziert. Das junge Alter der OVX Ratten, kombiniert mit dem LCD erlaubt, um einen niedrigen maximalen Knochenmasse, postmenopausalen Osteoporose imitiert, indem Sie zu irreversiblen Knochenverlust führt zu erreichen. Dies lässt sich teilweise durch die Tatsache, dass, während der LCD-Anzeige auf ca. 3 Monate alt, die Ratten Übergang vom Knochen zur Umgestaltung Modellierung an den Lendenwirbeln33, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Aufrechterhaltung der Osteoporose über phase Zeit. Verwendung von jungen Tieren macht dieses Modell kostengünstiger, da sie weniger Kosten. Dennoch ist es begrenzt durch die biologischen Veränderungen im Altern Tier von Natur aus nicht entfallen.

<table><tbody><tr><td>Isofluran</td><td>MWI Animal Health, Pasadena, CA</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>BetadineSolution</td><td>MWI Animal Health, Pasadena, CA</td><td>4677</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidingluconat 2% scrub</td><td>MWI Animal Health, Pasadena, CA</td><td>510083</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol 70%-Quart</td><td>MWI Animal Health, Pasadena, CA</td><td>501044</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>MWI Animal Health, Pasadena, CA</td><td>26357</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin 0,3 mg/mL</td><td>MWI Animal Health, Pasadena, CA</td><td>56163</td><td></td></tr><tr><td>Ovariektomierte athyme Nacktratten</td><td>Harlan Laboratories, Indianapolis, IN</td><td>Hsd:RH-Foxn1 rnu</td><td></td></tr><tr><td>Lebensmittel mit niedrigem Kalziumgehalt</td><td>Newco Distributors, Inc., CA</td><td>1814948 (5AV8 AIN-93M mit niedrigem Kalzium)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Life Technologies Corporation</td><td></td><td></td>14190250</tr><tr><td>Dermabond</td><td>J AND J ETHICON</td><td>DHVM12</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesiegerät</td><td>Patterson Scientific</td><td>TEC 3EX</td><td></td></tr><tr><td>Slide Top Induktionskammern</td><td>Patterson Scientific</td><td>78917833</td><td></td></tr><tr><td>ProStation Beheizter Arbeitsplatz</td><td>Patterson Scientific</td><td>78914731</td><td></td></tr><tr><td>OP-Abdecktuch</td><td>HALYARD HEALTH INC</td><td>89101</td><td></td></tr><tr><td>Rückzugssystem für magnetische Fixateure</td><td>Fine Science Tools, Inc., CA</td><td>18200-50</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere, 10 cm, gebogen, SS</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>14394</td><td></td></tr><tr><td>Irisschere, 11,5 cm, 45 > Winkel, gezahnt, scharf/scharf</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>503225</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette, Nr. 5</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>555048FT</td><td></td></tr><tr><td>Micro Mosquito Hämostatische Pinzette</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>503360</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Baumwollgaze</td><td>Medtronic, MINNEAPOLIS, MN</td><td>9024</td><td></td></tr><tr><td>Absorptionsspeere - gefasst/steril</td><td>Fine Science Werkzeuge, CA</td><td>18105-01</td><td></td></tr><tr><td>Spritze, 1 mL</td><td>TERUMO TERUMO MED</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Nadel, 25 Gauge</td><td>BD MED SYS INJEKTIONSSYSTEM</td><td></td><td></td></tr> 305127 <tr><td>Laminar-Flow-Haube</td><td>Baker</td><td>SterilGARD e3-Klasse II Typ A2 Biosicherheitswerkbank</td><td></td></tr><tr><td>Thermische Kautereinheit</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>501292</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Drill OmniDrill115/230V</td><td>World Precision Instruments, FL</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Trephines für Mikrobohrer, 2 mm Durchmesser</td><td>Fine Science Tools, CA</td><td>18004-20</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Vicryl ungefärbt 27" SH Taper</td><td>J AND J</td><td>ETHICON 1663G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Ethilon schwarz 18" PC3 konventionelles Schneiden</td><td>J AND J ETHICON</td><td>1954G</td><td></td></tr><tr><td>Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40)</td><td>Scanco Medical</td><td>vivaCT 40</td><td></td></tr><tr><td>SCANCO Medical microCT systems software suite</td><td>Scanco Medical</td><td>vivaCT 40</td><td></td></tr><tr><td>Analyze software</td><td>Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN</td><td>Analyze 12</td><td>Bildanalysesoftware</td></tr><tr><td>Veterenery Augensalbe</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

parallelisierter längs microcomputed tomographie-basierten quantitativen strukturanalyse von einem nackten rattenmodell osteoporose bedingte wirbelfraktur

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Im Zusammenhang mit Osteoporose vertebrale Kompressionsfrakturen (OVCFs) sind eine gemeinsame und klinisch ungedeckten Bedarf mit zunehmender Prävalenz als die Bevölkerung altert. OVCF Tiermodelle sind unerlässlich, um die präklinische Entwicklung von translational Tissue engineering Strategien. Während eine Reihe von Modellen derzeit vorhanden sind, beschreibt dieses Protokoll eine optimierte Methode zur Induktion von mehreren hoch reproduzierbare Wirbelkörper Mängel in eine einzige nackte Ratte. Eine neuartige längs parallelisierter Microcomputed Tomographie (µCT)-auf der Grundlage quantitative Strukturanalyse der Wirbelkörper Mängel ist auch detailliert. Kurz, wurden Ratten auf mehrere Zeit Punkte postoperative abgebildet. Tag 1-Scan wurde neu ausgerichtet, um eine standard-Position und einem Standardvolumen von Interesse war definiert. Nachfolgende µCT-Scans von jede Ratte wurden automatisch zum Tag 1 Scan registriert, so dass die gleiche Menge an Interesse anschließend analysiert wurde, um für neue Knochenbildung zu bewerten. Dieser vielseitige Ansatz kann zu einer Vielzahl anderer Modelle angepasst werden, wo Imaging-basierte Längsschnittanalyse von präzise 3D parallelisierter Ausrichtung profitieren könnten. Zusammen genommen, beschreibt dieses Protokoll ein leicht quantifizierbare und leicht reproduzierbare System für Osteoporose und Knochen. Das vorgeschlagene Protokoll dauert 4 Monate induzieren Osteoporose in nude ovariectomized Ratten und zwischen 2,7 und 4 h zu generieren, Bild und zwei Wirbelkörper Mängel je nach Gewebe Größe und Ausstattung zu analysieren.

Mit diesem Protokoll, kann man Bild und quantifizieren die Regeneration von n = 8 modellierten osteoporotischen Wirbelkörper Mängel in verschiedenen Zeitpunkten. Die anatomische Übereinstimmung erhalten durch das Eintragungsverfahren ermöglicht die Analyse der gleichen VOI zu allen Zeitpunkten. Daraus resultiert eine hochgenaue längs 3D Histomorphometric Analyse, sogar am Rande des ursprünglichen Mangels nicht mehr erkennbar sind. Wir haben fünf Zeitpunkten (Tag 1, Woche 2, Woche 4, Woche...

Das Ziel dieses Protokolls ist eine nackte im Zusammenhang mit Osteoporose vertebrale Kompression Bruch Rattenmodell zu generieren, die längs bewertet in Vivo mit einer parallelisierter Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse werden können.

Parallelisierter längs Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse von einem nackten Rattenmodell Osteoporose bedingte Wirbelfraktur

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Das übergeordnete Ziel dieses chirurgischen Modells und der Bildanalysemethode besteht darin, die Wirkung Ihrer Behandlung an einem präklinischen Modell für osteoporosebedingte Wirbelkörperkompressionsfrakturen zu beobachten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der glialen regenerativen Medizin zu beantworten, beispielsweise welche Behandlung bei osteoporosebedingten Wirbelkörperkompressionsfrakturen wirksam sein könnte und wie eine solche Therapie die Knochenregeneration unterstützen würde. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie Nacktratten verwendet, sodass neuartige Behandlungen in vivo getestet werden können, ohne dass Abstoßungsreaktionen durch das Immunsystem zu berücksichtigen sind.Außerdem unterliegt die Knochenregeneration bei dieser hier vorgestellten Methode einer halbautomatisierten Prozedur, wodurch sie genauer und weniger vom Anwender abhängig ist als zuvor veröffentlichte Methoden. Die Durchführung der Prozedur demonstriert Doctor Wafa Tawackoli, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus unserem Labor. Zunächst wird bei einer osteoporotischen Ratte eine Anästhesie mit 5 % Isofluran in 100 % Sauerstoff induziert, anschließend wird die Ratte auf eine Nasenkonne über zwei bis 3 % Isofluran zur Aufrechterhaltung der Narkose umgestellt.Rasieren Sie den Bauchbereich mit einem elektrischen Rasierer. Desinfizieren Sie die Stelle mit einem Jod-haltigen Antiseptikum in 0,5 % Chlorhexidin-Gluconat, gefolgt von 70 % Ethanol. Tragen Sie Tierarzneisalbe auf die Augen auf, um Austrocknung während der Narkose zu verhindern.Ein Stoßfesseldruckreiz wird angewendet, um eine ausreichende Narkosetiefe zu überprüfen. Falls keine Reaktion festgestellt wird, wird das Verfahren eingeleitet. Die anästhesierte Ratte wird in Rückenlage auf eine auf 37 Grad Celsius eingestellte Heizplatte gelegt, und die Gliedmaßen werden mithilfe eines magnetischen Fixatorsystems gestreckt.Spritzen Sie die Ratte vor Beginn des chirurgischen Eingriffs subkutan mit Carprofen. Nachdem Sie einen fünf bis acht Zentimeter langen Schnitt in die Haut gemacht haben, beginnend einen Zentimeter unterhalb des Xiphoidprozesses und entlang der Mittellinie, verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Aponeurose entlang der Linea alba zu eröffnen und so auf die Bauchhöhle zuzugreifen. Legen Sie die Bauchhöhle mit Retraktoren frei.Lenken Sie den Darm nach rechts zur Ratte, um die Bauchaorta und die linke Niere freizulegen. Um Austrocknung zu vermeiden, wickeln Sie die inneren Organe mit sterilen, angefeuchteten Mullkompressen ein. Verwenden Sie gegebenenfalls zusätzliche Retraktoren, um die Aorta freizulegen.Tasten Sie die Lendenwirbelsäule ab und setzen Sie diese anschließend frei. Verwenden Sie eine Thermo-Kauterisierung, um die vordere Seite der Lendenwirbelkörper L4 bis L5 freizulegen und diese vom umgebenden Bindegewebe und den Muskeln zu isolieren. Entfernen Sie mit einem Wattestäbchen Blut und Restgewebe vom L4-Wirbel.Verwenden Sie anschließend einen sterilen Bohrer mit zwei Zentimeter Durchmesser, um einen fünf Millimeter tiefen Knochendefekt in der Mitte der exponierten vorderen Fläche des Wirbelkörpers anzulegen. Wenden Sie minimale Druckkraft an, um lediglich die ventrale Kortikalis und den darunterliegenden trabekulären Knochen zu durchbohren. Vermeiden Sie es, die dorsale Kortikalis zu durchbohren.Bohren Sie dann die L5-Wirbel auf die gleiche Weise, um zwei Defekte pro Ratte zu erzeugen. Sobald das Bohren abgeschlossen ist, bringen Sie die Eingeweide in die Bauchhöhle zurück und entfernen Sie die Retraktoren. Anschließend nähen Sie die Aponeurose mit einer synthetischen, resorbierbaren Vicryl-Chirurgienähten in kontinuierlicher Nahttechnik.Schließen Sie die Haut mit einer nicht resorbierbaren Monofile-Nylonnaht 4-0 in einfacher Einzelknopfnahttechnik. Anschließend 100 Mikroliter topisches Hautklebemittel oberhalb und zwischen den Hautnähten auftragen, um einen vollständigen Verschluss der Haut sicherzustellen. Nach der Injektion von Ringer-Laktat-Lösung mit 37 Grad Celsius zur Verhinderung von Hypothermie und Dehydrierung sowie Buprenorphin zur postoperativen Schmerzlinderung das Tier auf der Heizplatte aus der Narkose aufwachen lassen.Am Tag nach dem chirurgischen Eingriff Anästhesie wie zuvor mit Isofluran einleiten. Die Ratte mittels eines in-vivo-Mikro-CT-Scanners scannen. Nach der Aufnahme und dem Erwachen aus der Narkose die Ratte in den Heimkäfig zurückbringen.Um die Wirbel-Daten zur Analyse zu trennen, klicken Sie auf das Mikro-CT-Auswertungsprogramm und wählen Sie die Probe aus dem Menü aus. Umreißen Sie dann mit der Maus einzelne Wirbel auf einer Schicht. Verwenden Sie die Z-Leiste, um zur nächsten Schicht zu wechseln, und umreißen Sie die einzelnen Wirbel auf die gleiche Weise.Speichern Sie die konturierte Wirbelkörper als separate Datei, indem Sie alle paar Schnitte auf Datei, GOBJ speichern klicken. Importieren Sie anschließend nach Einstellung der Referenzwirbelkörper in eine Mikro-CT-Umgebung. Wenden Sie das für die Referenzwirbelkörper definierte VOI auf die registrierte Zielwirbelkörper an, indem Sie Mikro-CT-Auswertungsprogramm, Datei, GOBJ laden auswählen und das zuvor erstellte GOBJ auswählen.Senden Sie schließlich das VOI zur Auswertung mit einem Mikro-CT-Auswertungsprogramm. Dieses frontale 3D-Bild zeigt ein repräsentatives Bild eines Wirbeldefekts einen Tag nach der Defekterzeugung. Die Knochenbildung im Hohlraum ist rot markiert.Dies ist ein sagittales 2D-Bild desselben Bereichs und abschließend ein axiales 2D-Bild. Wie hier zu sehen ist, erfolgt die Knochenbildung im Laufe der Zeit und wird mittels longitudinaler Bildgebung nachgewiesen. Die Knochenvolumendichte und die scheinbare Dichte wurden berechnet und mithilfe einer wiederholten zweifaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit Bonferroni-Korrektur für multiple Vergleiche verglichen. Wie hier zu sehen, nehmen die Knochendichte und die scheinbare Dichte signifikant ab zwei Wochen nach der Erzeugung des Wirbelsäulendefekts zu. Nach dieser Prozedur können weitere Methoden wie Histologie und Immunhistochemie angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, welche Zellen vorhanden sind und welche Proteine im Defekt exprimiert werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mehrere Wirbelsäulendefekte bei Nude-Ratten erzeugt und die Knochenregeneration in diesen Defekten über die Zeit analysiert.

semiautomated-longitudinal-microcomputed-tomography-based

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Ein Längs-Untersuchung von Knochenschwund in der Oberschenkel-und Schienbein von erwachsenen Mäusen wurde nach Verletzungen des Rückenmarks mit sequentieller low-dose X-ray-Scans durchgeführt. Tibia Knochenverlust wurde während der Studie festgestellt, während Knochenverlust in den Oberschenkelknochen wurde erst 40 Tage nach der Verletzung festgestellt.

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Knochenverlust nach Rückenmarksverletzungen mit Novel, In vivo Methodology

Dieses Papier weist Benutzer in Vivo Mikro-Computertomographie (µCT) Scanner wie betäuben, richtig positionieren und zurückhalten der Hind Gliedmaßen einer Ratte für minimale Bewegung während der hochauflösenden Bildgebung des Schienbeins. Das Ergebnis sind qualitativ hochwertige Bilder, die bearbeitet werden können, um genau zu quantifizieren, Knochen-Mikroarchitektur.

Die richtige Positionierung und Zurückhaltung einer Ratte Hind Extremität für fokussierte hochauflösende Bildgebung von Knochen-Mikroarchitektur mit In Vivo Mikro-Computertomographie

Wir präsentieren einen Workflow für die Segmentierung und Quantifizierung der trabekuläre Knochen für 2D und 3D Bilder basierend auf den Knochen äußere Begrenzung mit ImageJ-Plugin. Dieser Ansatz ist effizienter und genauer als der aktuelle manuelle Hand-Konturierung Ansatz und bietet Schicht für Schicht Quantifizierungen, die nicht im aktuellen kommerziellen Software verfügbar sind.

Äußere Begrenzung unterstützt Segmentierung und Quantifizierung der trabekulären Knochen durch eine Imagej-Plugin

Die Mikro-Computertomographie (μCT) ist ein zerstörungsfreies bildgebendes Verfahren, das in präklinischen Studien zur Beurteilung der Knochenstruktur beiträgt, jedoch gibt es keinen Konsens über μCT-Verfahren zur Analyse der knochenheilenden Kallus. Diese Studie bietet ein schrittweises μCT-Protokoll, das die Überwachung der Frakturheilung ermöglicht.

Beurteilung der Knochenbruchheilung mittels Mikro-Computertomographie

Dieses Protokoll stellt eine kostengünstige und effiziente Methode zur quantitativen Bewertung der Knochenmikroarchitektur in einem Mausmodell der Osteoporose dar, indem Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung und Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) kombiniert werden.

Bewertung der trabekulären Knochenmikroarchitektur in einem Osteoporose-Mausmodell

Das Protokoll zeigt den Aufbau eines einfachen und kostengünstigen Trainingsmodells für die Steroid-induzierte Osteonekrose des Hüftkopfes unter Verwendung eines elastischen therapeutischen Tapes.

Spannungsfreies gewichtstragendes Modell der steroidinduzierten Osteonekrose des Femurkopfes bei Ratten

Dieses Protokoll verwendet Mikro-Computertomographie, um eine kostengünstige Quantifizierung der fettfreien Masse zu ermöglichen, einschließlich Skelettmuskel- und Viszeralgewebe, Fettgewebe und Skelettgewebe bei Kleintieren. Sie unterscheidet zwischen magerem und fettem Gewebe, was für die biomedizinische Forschung, insbesondere in der translationalen Forschung an Kleintieren, erhebliche Vorteile bietet.

Nicht-invasive Quantifizierung der Skelettmuskulatur bei Kleintieren mittels Mikro-Computertomographie

Wir stellen eine Methode zur Analyse einer benutzerdefinierten Region of Interest (ROI) in einem longitudinalen in vivo Ratten-Radialdefektmodell vor. Diese Methode ermöglicht eine vergleichende Analyse zwischen verschiedenen Gerüsten, die zuvor durch Schwankungen des Sichtfelds des Scans mit Mikrocomputertomographie (μCT), der Probenorientierung und der Basislinienpräsenz des Gerüsts begrenzt waren.

Längsschnitt-Mikro-Computertomographie-Bildanalyse für benutzerdefinierte Region of Interest bei Knochendefekten kritischer Größe

Wir schlagen ein Protokoll zur Bewertung der Knochenregeneration auf verschiedenen hierarchischen Ebenen vor. Dieser multimodale Ansatz ermöglicht Strukturanalysen über verschiedene Längenskalen hinweg und adressiert so effektiv Herausforderungen bei der Probenvorbereitung. Es bietet zudem einen zuverlässigen Arbeitsablauf zur Bewertung der Wirksamkeit von Biomaterialien bei der Förderung der Knochenregeneration.

Multimodaler Ansatz zur Bewertung der Knochenregeneration und der Gerüstleistung

Adhesive Mikrostrukturen, dass zelluläre Architektur normalisieren kann die Empfindlichkeit in der Detektion von Arzneimittelwirkungen, die Verbesserung der Reproduzierbarkeit und vereinfachen automatisierte Bildaufnahme und-analyse werden. Eine solche Technologie profitieren Arzneimittel / siRNA Screening-Assays, auf konventionellen Zellkultur unterstützt durchgeführt und somit leidet übermäßige Zelle zu Zelle Variabilität.

Verbesserte Visualisierung und quantitative Analyse von Arzneimittelwirkungen mit mikrostrukturierten Cells

Erfahren Sie die Erstellung eines Nacktrattenmodells für osteoporosebedingte Wirbelkompressionsfrakturen mit semiautomatisierter Mikro-CT-Analyse. Diese Methode ermöglicht präzise in-vivo-Evaluierung von Knochenregenerationstherapien.

Parallelisierter längs Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse von einem nackten Rattenmodell Osteoporose bedingte Wirbelfraktur (Video) | JoVE Journal

Parallelisierter längs Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse von einem nackten Rattenmodell Osteoporose bedingte Wirbelfraktur

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