Parallelisierter längs Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse von einem nackten Rattenmodell Osteoporose bedingte Wirbelfraktur

Das übergeordnete Ziel dieses chirurgischen Modells und der Bildanalysemethode besteht darin, die Wirkung Ihrer Behandlung an einem präklinischen Modell für osteoporosebedingte Wirbelkörperkompressionsfrakturen zu beobachten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der glialen regenerativen Medizin zu beantworten, beispielsweise welche Behandlung bei osteoporosebedingten Wirbelkörperkompressionsfrakturen wirksam sein könnte und wie eine solche Therapie die Knochenregeneration unterstützen würde. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie Nacktratten verwendet, sodass neuartige Behandlungen in vivo getestet werden können, ohne dass Abstoßungsreaktionen durch das Immunsystem zu berücksichtigen sind.

Außerdem unterliegt die Knochenregeneration bei dieser hier vorgestellten Methode einer halbautomatisierten Prozedur, wodurch sie genauer und weniger vom Anwender abhängig ist als zuvor veröffentlichte Methoden. Die Durchführung der Prozedur demonstriert Doctor Wafa Tawackoli, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus unserem Labor. Zunächst wird bei einer osteoporotischen Ratte eine Anästhesie mit 5 % Isofluran in 100 % Sauerstoff induziert, anschließend wird die Ratte auf eine Nasenkonne über zwei bis 3 % Isofluran zur Aufrechterhaltung der Narkose umgestellt.

Rasieren Sie den Bauchbereich mit einem elektrischen Rasierer. Desinfizieren Sie die Stelle mit einem Jod-haltigen Antiseptikum in 0,5 % Chlorhexidin-Gluconat, gefolgt von 70 % Ethanol. Tragen Sie Tierarzneisalbe auf die Augen auf, um Austrocknung während der Narkose zu verhindern.

Ein Stoßfesseldruckreiz wird angewendet, um eine ausreichende Narkosetiefe zu überprüfen. Falls keine Reaktion festgestellt wird, wird das Verfahren eingeleitet. Die anästhesierte Ratte wird in Rückenlage auf eine auf 37 Grad Celsius eingestellte Heizplatte gelegt, und die Gliedmaßen werden mithilfe eines magnetischen Fixatorsystems gestreckt.

Spritzen Sie die Ratte vor Beginn des chirurgischen Eingriffs subkutan mit Carprofen. Nachdem Sie einen fünf bis acht Zentimeter langen Schnitt in die Haut gemacht haben, beginnend einen Zentimeter unterhalb des Xiphoidprozesses und entlang der Mittellinie, verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Aponeurose entlang der Linea alba zu eröffnen und so auf die Bauchhöhle zuzugreifen. Legen Sie die Bauchhöhle mit Retraktoren frei.

Lenken Sie den Darm nach rechts zur Ratte, um die Bauchaorta und die linke Niere freizulegen. Um Austrocknung zu vermeiden, wickeln Sie die inneren Organe mit sterilen, angefeuchteten Mullkompressen ein. Verwenden Sie gegebenenfalls zusätzliche Retraktoren, um die Aorta freizulegen.

Tasten Sie die Lendenwirbelsäule ab und setzen Sie diese anschließend frei. Verwenden Sie eine Thermo-Kauterisierung, um die vordere Seite der Lendenwirbelkörper L4 bis L5 freizulegen und diese vom umgebenden Bindegewebe und den Muskeln zu isolieren. Entfernen Sie mit einem Wattestäbchen Blut und Restgewebe vom L4-Wirbel.

Verwenden Sie anschließend einen sterilen Bohrer mit zwei Zentimeter Durchmesser, um einen fünf Millimeter tiefen Knochendefekt in der Mitte der exponierten vorderen Fläche des Wirbelkörpers anzulegen. Wenden Sie minimale Druckkraft an, um lediglich die ventrale Kortikalis und den darunterliegenden trabekulären Knochen zu durchbohren. Vermeiden Sie es, die dorsale Kortikalis zu durchbohren.

Bohren Sie dann die L5-Wirbel auf die gleiche Weise, um zwei Defekte pro Ratte zu erzeugen. Sobald das Bohren abgeschlossen ist, bringen Sie die Eingeweide in die Bauchhöhle zurück und entfernen Sie die Retraktoren. Anschließend nähen Sie die Aponeurose mit einer synthetischen, resorbierbaren Vicryl-Chirurgienähten in kontinuierlicher Nahttechnik.

Schließen Sie die Haut mit einer nicht resorbierbaren Monofile-Nylonnaht 4-0 in einfacher Einzelknopfnahttechnik. Anschließend 100 Mikroliter topisches Hautklebemittel oberhalb und zwischen den Hautnähten auftragen, um einen vollständigen Verschluss der Haut sicherzustellen. Nach der Injektion von Ringer-Laktat-Lösung mit 37 Grad Celsius zur Verhinderung von Hypothermie und Dehydrierung sowie Buprenorphin zur postoperativen Schmerzlinderung das Tier auf der Heizplatte aus der Narkose aufwachen lassen.

Am Tag nach dem chirurgischen Eingriff Anästhesie wie zuvor mit Isofluran einleiten. Die Ratte mittels eines in-vivo-Mikro-CT-Scanners scannen. Nach der Aufnahme und dem Erwachen aus der Narkose die Ratte in den Heimkäfig zurückbringen.

Um die Wirbel-Daten zur Analyse zu trennen, klicken Sie auf das Mikro-CT-Auswertungsprogramm und wählen Sie die Probe aus dem Menü aus. Umreißen Sie dann mit der Maus einzelne Wirbel auf einer Schicht. Verwenden Sie die Z-Leiste, um zur nächsten Schicht zu wechseln, und umreißen Sie die einzelnen Wirbel auf die gleiche Weise.

Speichern Sie die konturierte Wirbelkörper als separate Datei, indem Sie alle paar Schnitte auf Datei, GOBJ speichern klicken. Importieren Sie anschließend nach Einstellung der Referenzwirbelkörper in eine Mikro-CT-Umgebung. Wenden Sie das für die Referenzwirbelkörper definierte VOI auf die registrierte Zielwirbelkörper an, indem Sie Mikro-CT-Auswertungsprogramm, Datei, GOBJ laden auswählen und das zuvor erstellte GOBJ auswählen.

Senden Sie schließlich das VOI zur Auswertung mit einem Mikro-CT-Auswertungsprogramm. Dieses frontale 3D-Bild zeigt ein repräsentatives Bild eines Wirbeldefekts einen Tag nach der Defekterzeugung. Die Knochenbildung im Hohlraum ist rot markiert.

Dies ist ein sagittales 2D-Bild desselben Bereichs und abschließend ein axiales 2D-Bild. Wie hier zu sehen ist, erfolgt die Knochenbildung im Laufe der Zeit und wird mittels longitudinaler Bildgebung nachgewiesen. Die Knochenvolumendichte und die scheinbare Dichte wurden berechnet und mithilfe einer wiederholten zweifaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit Bonferroni-Korrektur für multiple Vergleiche verglichen.

Wie hier zu sehen, nehmen die Knochendichte und die scheinbare Dichte signifikant ab zwei Wochen nach der Erzeugung des Wirbelsäulendefekts zu. Nach dieser Prozedur können weitere Methoden wie Histologie und Immunhistochemie angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, welche Zellen vorhanden sind und welche Proteine im Defekt exprimiert werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mehrere Wirbelsäulendefekte bei Nude-Ratten erzeugt und die Knochenregeneration in diesen Defekten über die Zeit analysiert.