Vorbereitung von in Agarperlen eingebettetem Mycobacterium abscessus zur intratrachealen Inokulation immunkompetenter Mäuse

Wir entwickeln ein Mausmodell für chronische Mycobacterium-Abszesse, Lungeninfektionen, um die Wirksamkeit von Antibiotika in präklinischen Studien zu testen. Die erste Herausforderung besteht darin, die intrinsische Resistenz von Mäusen gegen Mycobacterium-Abszesse zu überwinden. Die zweite Herausforderung besteht darin, eine reproduzierbare Charge von Agarbeat-eingebetteten Bakterien für intratracheale Infektionen zu generieren. Wir möchten ein detailliertes Protokoll der Vorbereitung und Infektion von Agar-Beats vorstellen, das von anderen Labors leicht implementiert werden kann, um neue Medikamente an Mäusen zu testen.

Die Infektion mit Agar-Beat-eingebetteten Bakterien anstelle von freien Bakterien überwindet teilweise die Fähigkeit immunkompetenter Mäuse, die Infektion spontan zu beseitigen. Dieses Modell bietet ein robustes präklinisches Instrument zur Evaluierung neuer Antibiotika gegen Mycobacterium abscessus und erleichtert die Entdeckung und Entwicklung dringend benötigter Antibiotika gegen Lungeninfektionen.

[Dozent] Zu Beginn erhalten Sie exponentiell wachsende Mycobacterium abscessus-Suspensionskulturen, die auf eine optische Dichte von 30 eingestellt sind. Übertragen Sie 27 Milliliter geschmolzene Triptychon-Sojaschnecke, die bei 50 Grad Celsius voräquilibriert wurde, in ein Röhrchen mit drei Millilitern Bakteriensuspension. Mischen Sie die Suspension durch Pipettieren. Pipettieren Sie die Bakterienschneckenmischung vorsichtig in einen Kolben mit 60 Millilitern Mineralöl in einem Kolben. Der Kolben wird in einen Sekundärbehälter gestellt und sofort mit einem Magnetrührstab bei mittlerer Geschwindigkeit unter magnetischem Rühren gerührt. Stellen Sie sicher, dass sich ein sichtbarer Wirbel in der Ölschneckenmischung bildet, und rühren Sie sechs Minuten lang bei Raumtemperatur weiter. Lege Eis in den Sekundärbehälter, damit die Suspension abkühlen kann. Füllen Sie dann die Güllemischung in 250-Milliliter-Zentrifugenröhrchen um. Zentrifugieren Sie die Suspension in den ersten fünf Zyklen sechs Minuten lang bei 3.700 g bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie das Schneckenkugelpellet mit DPBS. Montieren Sie außerdem ein Trichterzellensieb, einen Verbindungsring und ein 50-Milliliter-Rohr zu einer einzigen Einheit. Nach der 10. Wäsche resuspendieren Sie das Pellet und verdünnen Sie die Bead-Suspension viermal. Geben Sie das verdünnte Probenmaterial auf das Sieb, um die Bead-Suspension zu filtrieren. Ziehen Sie langsam am Kolben einer 30-Milliliter-Spritze, die am Verbindungsring befestigt ist, um einen Sog zu erzeugen und die Filtration zu verbessern. Anschließend wird die verdünnte Suspension bei 1000 g zwei Minuten lang zentrifugiert, um sie zu konzentrieren. Nachdem Sie die Kügelchen in ein 50-Milliliter-Röhrchen gezogen haben, lagern Sie sie bis zu einer Woche lang bei vier Grad Celsius, bereiten Sie jedoch für jede Versuchscharge frische Kügelchen vor. Zu Beginn fixieren Sie sedierte CD One-Mäuse mit einem speziell angefertigten dreidimensionalen, bedruckten, geneigten Ständer. Sichern Sie die Maus an ihren Schneidezähnen mit einer Nahtschnur, die am Mittelstab des Ständers befestigt ist. Positionieren Sie die Maus in einer ventralen liegenden Haltung mit erhobenem Kopf. Befestigen Sie eine 24-Gauge-Tierfütterungsnadel aus Metall an einer Glasspritze, die mit Mycobacterium abscessus Schneckenperlensuspension gefüllt ist. Platzieren Sie Nylonklammern oder -stopper auf dem Kolben, um ein kontrolliertes Inokulumvolumen von 50 Mikrolitern pro Maus zu gewährleisten. Positionieren Sie nun die Metall-Sondennadel senkrecht über der Maus. Führen Sie die Nadel vorsichtig oben ein und schieben Sie sie weiter nach unten in die Luftröhre. Entfernen Sie den Nylonclip oder -stopfen und geben Sie langsam 50 Mikroliter Mycobacterium abscessus Schneckenperlensuspension in die Lunge ab. Lassen Sie die Maus fünf Minuten ruhen. Wiederholen Sie dann den Impfvorgang ein zweites Mal, um eine tiefe und reproduzierbare Ablagerung des vollständigen Inokulums in die Lunge zu gewährleisten. Schneckenkügelchen, die Mycobacterium abscessus enthielten, exprimierten mKirschrot fluoreszierendes Protein und variierten in der Größe von etwa 70 bis 250 Mikrometern. Die bakterielle Belastung von sechs unabhängigen Kügelpräparaten zeigte eine hohe Reproduzierbarkeit. Die Bakterienzählung vor und nach dem Passieren der Glasspritze zeigte keinen signifikanten Verlust der bakteriellen Belastung. Die intertracheale Inokulationsmethode war bei drei unabhängigen Bead-Präparaten reproduzierbar, wie die CFU-Zählungen der Lunge 24 Stunden nach der Infektion zeigten. Die Reproduzierbarkeit der Infektion zwischen drei unabhängigen Operateuren wurde bestätigt, da die Anzahl der Lungen-KBE 24 Stunden nach der Infektion in allen Gruppen konstant blieb.