Ein kardiales mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Ca2⁺ -Ausbreitung durch nicht-genetische optische Stimulation

Die Forschung zielt darauf ab, in vitro kardiale mikrophysiologische Modelle durch die Integration materialbasierter Photostimulationsmethoden weiterzuentwickeln. Es konzentriert sich auf die Überwindung von Einschränkungen bei der Langlebigkeit und Stimulationsinvasivität, bietet zuverlässige Werkzeuge für die Untersuchung der Herzphysiologie, die Verbesserung von Wirkstoff-Screening-Prozessen und die Förderung von Anwendungen in der Krankheitsmodellierung. Die jüngsten Fortschritte in der Biostimulation nutzen die Hebelwirkung, z. B. für eine präzise nicht-invasive Zellkontrolle.

Die Optogenetik ermöglicht die genetische Modifikation, um die zelluläre Aktivität zu regulieren, während neue materialbasierte Photowandler nicht-genetische Alternativen bieten. Diese Innovation stellt einen bedeutenden Durchbruch bei der Untersuchung und Modulation von Neuronen, Kardiomyozyten und Skelettmuskelzellen in verschiedenen Anwendungen dar. Zu den aktuellen experimentellen Herausforderungen gehören die Erzielung einer konsistenten Lichtabgabe in tiefe Gewebe, die Optimierung der Biokompatibilität und Stabilität von Photowandlern und die Verbesserung der Präzision lichtbasierter Stimulationstechniken.

Darüber hinaus bleibt die Integration dieser Methoden in komplexe biologische Systeme bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der zellulären Lebensfähigkeit und Funktionalität eine wichtige Hürde. Dieses Protokoll adressiert die Forschungslücke des Bedarfs an nicht-invasiven präzisen Stimulationstechniken in kardialen mikrophysiologischen Modellen. Durch die Verwendung von materialbasierten Photowandlern wie Ziapin2 überwindet dieser Ansatz die Einschränkungen der traditionellen elektrischen Stimulation und Optogenetik und bietet eine verbesserte zeitliche und räumliche Kontur bei gleichzeitiger Erhaltung der Lebensfähigkeit und Funktion des Gewebes.

Meine Ergebnisse werden die Forschung voranbringen, indem sie eine nicht-invasive, materialbasierte Lichtstimulationstechnik einführen, die eine größere Präzision und Kontrolle über die zelluläre Aktivität im Herzgewebe bietet. Dieser Ansatz macht genetische Modifikationen überflüssig und bietet ein vielseitiges Werkzeug für die Modellierung der Herzfunktion, die Untersuchung von Krankheitsmechanismen und die Entwicklung effektiverer therapeutischer Strategien. Kleben Sie zunächst zwei Schichten Laborklebeband, eine weiße und eine blaue, auf eine ein Millimeter dicke, klare, kratz- und UV-beständige Acrylplatte.

Schneiden Sie das Chipmuster auf dem Band entsprechend dem beabsichtigten Design aus und schneiden Sie dann mit einem Kohlendioxid-Lasergravierer die Acrylplatte in Kreise. Entfernen Sie die beiden Lagen Klebeband in der innersten Linie mit einer Pinzette. Weichen Sie die Chips 30 Minuten bis eine Stunde lang in reinem Bleichmittel ein, um dicke Linien und dunkle Flecken vom Schnitt zu entfernen, die eine scharfe Linie hinterlassen, und spülen Sie die Chips in einem Becherglas mit fließendem deionisiertem Wasser über Nacht oder mindestens drei Stunden lang ab.

Beschallen Sie die Chips 10 Minuten lang mit den Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Stempeln und 30 Minuten lang mit Linienrillen in sauberem 70%igem Ethanol. Bringen Sie die Chips und Stempel an einen sauberen Ort unter einer Haube und lassen Sie sie etwa ein bis zwei Stunden lang unter dem Luftstrom trocknen. Anschließend die frisch zubereitete Gelatine 15 Minuten lang beschallen und dann bis zur Verwendung wieder in das 65 Grad Celsius warme Wasserbad stellen.

Legen Sie die mikrobielle Transglutaminase oder das MTG-Röhrchen in einen Exsikkator, wobei die Kappe leicht gelockert ist, und schalten Sie das Vakuum langsam ein, um die Blasen zu entfernen. Nach der Entgasung stellen Sie das MTG-Rohr wieder in das 37 Grad Celsius heiße Wasserbad. Decken Sie dann ein Gitterblech mit sauberem Parafilm ab und legen Sie die Chips auf den Rost.

Bewahren Sie den PDMS-Stempel zur Verwendung in der Nähe auf. Fügen Sie fünf Milliliter MTG zu fünf Millilitern der Gelatinelösung hinzu und pipettieren Sie vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. Aliquotieren Sie nun schnell etwa 0,5 Milliliter der Gelatinemischung auf jeden Chip, um sicherzustellen, dass die Mischung den Chipbereich bedeckt.

Platzieren Sie den linienförmigen PDMS-Stempel darauf und tragen Sie ein 200-Gramm-Gewicht auf, um sicherzustellen, dass die Gelatine parallel zur Längsachse des Gewebes gemustert ist. Sobald alle Chips geformt sind, decken Sie sie mit einem Glas ab, um Umwelteinflüsse zu vermeiden und sie über Nacht vernetzen zu lassen. Übertragen Sie den Chip und den PDMS-Stempel in eine neue, mit PBS gefüllte P150-Schale, um die Gelatine 30 Minuten bis eine Stunde lang zu hydratisieren, um die Trennung des PDMS-Stempels vom Chip zu erleichtern.

Nachdem Sie überschüssige Gelatine um den Chip entfernt haben, geben Sie den sauberen Chip in eine neue P150-Schale, die mit PBS gefüllt ist. Lagern Sie die PDMS-Stempel in 70%Ethanol. Um die Chips zu sterilisieren, weichen Sie sie 10 Minuten lang unter der Haube in Ethanol ein.

Übertragen Sie die Chips auf PBS, weichen Sie sie 10 Minuten lang ein, gefolgt von einer dreimaligen PBS-Wäsche. Für die Beschichtungslösungen mischen Sie 20 Mikrogramm pro Milliliter Fibronektin mit einer Verdünnung von 1 bis 100 Uhr Geltrex in Kulturmedien ohne Zusatz. Beschichten Sie die Chips zwei Stunden lang mit dieser Lösung in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Vom Menschen induzierte pluripotente Stammzell-Kardiomyozyten in RPMI-Medium, das 10 mikromolare Y-27632 enthält, auftauen und aussäen. Ersetzen Sie das Medium nach 24 Stunden durch ein RPMI ohne Y-27632. Entfernen Sie drei Tage nach der Zellaussaat vorsichtig mit einer Pinzette das weiße Klebeband von den Chips.

Bereiten Sie die optische Abbildungsapparatur vor, die aus einem modifizierten Tandemobjektivmikroskop besteht, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera und einer 200-Milliwatt-Quecksilberlampe als Anregungslichtquelle ausgestattet ist. Platzieren Sie einen dichroitischen Spiegel vor der dafür vorgesehenen Kalzium-Bildgebungskamera. Für die optische Stimulation wenden Sie eine optische Punktstimulation an einem Ende des Gewebes mit einer LED-Lichtquelle an, um Ziapin2, den Photowandler, zu stimulieren.

Beschleunigen Sie das Gewebe mit einer Frequenz von 0,5 oder einem Hertz über eine zeitlich regulierte optische Faser, die einen Millimeter vom Gewebe entfernt positioniert ist. Inkubieren Sie die Probe mit zwei mikromolaren X-Rhod-1, die 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in das Kulturmedium gegeben werden. Nachdem Sie die Chips mit frischem Nährmedium gewaschen haben, überführen Sie sie in ein phenolrotfreies RPMI 1640-Medium, das mit B-27 minus Insulin und HEPES ergänzt wird.

Legen Sie die Gewebechips in eine temperaturgesteuerte Schüssel, die auf physiologische Temperatur eingestellt ist, und starten Sie die Aufnahmen mit einer Bildrate von 2,5 Bildern pro Sekunde. Die Ausbreitung von Kalziumwellen wurde erfolgreich visualisiert, mit einer klaren räumlichen und zeitlichen Auflösung während der Photostimulation bei Frequenzen von 0,5 oder einem Hertz, wobei die Leitungsgeschwindigkeiten mit etwa 4,5 Zentimetern pro Sekunde berechnet wurden, was mit physiologischen Werten übereinstimmt. Transiente Parameter von Kalzium, einschließlich Amplitude, Anstiegszeit, maximaler Zerfall, Steigung und Abklingzeit, waren zwischen Lichtstimulation und elektrischer Stimulation quantitativ ähnlich, was vergleichbare funktionelle Reaktionen bestätigt.