Trennung und differentielle Charakterisierung von mikrobiellen extrazellulären Vesikeln im Darm bei salzempfindlichen Ratten unter salzreichen Ernährungsbedingungen

Diese Forschung untersucht die Rolle der mikrobiellen extrazellulären Vesikel des Darms bei salzempfindlichen hypertensiven Ratten bei einer salzreichen Ernährung und untersucht, wie eine salzreiche Ernährung die Vesikel verändert und hypertensive und immunologische Wechselwirkungen beeinflusst. Zu den jüngsten Fortschritten auf diesem Gebiet gehören das Verständnis der Rolle der mikrobiellen extrazellulären Vesikel des Darms bei Bluthochdruck, die Bewertung der Auswirkungen einer salzreichen Ernährung auf die mikrobielle Vielfalt und die Implementierung pflanzlicher Interventionen, die auf Vesikel aus der Stoffwechsel- und Immunregulation abzielen. Zu den aktuellen experimentellen Herausforderungen gehören die Isolierung extrazellulärer Vesikel mit hoher Priorität, die Unterscheidung auch abgeleiteter Vesikel von Mikrobiom-Vesikeln und die Minimierung von Probenverlusten in den Standardfärbeprotokollen, um die Reproduzierbarkeit über Studien hinweg zu gewährleisten. Dieses Dichtegitter- und Zentrifugationsprotokoll bietet extrazellulären Vesikeln eine höhere Priorität mit verbesserter Integrität und Reproduzierbarkeit im Vergleich zu herkömmlichen Methoden, was eine zuverlässigere extrazelluläre Vesikelforschung im Darmmikrobiom in Hypertoniestudien ermöglicht.

[Erzähler] Füllen Sie zunächst fünf Gramm Kot in ein vorgewogenes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen um. Geben Sie 50 Milliliter vorgewärmtes 37 Grad Celsius endotoxinfreies PBS in das Röhrchen und drehen Sie das Röhrchen 30 Minuten lang. Kühlen Sie die Hochgeschwindigkeitszentrifuge auf 4 Grad Celsius ab. Legen Sie die Probe anschließend symmetrisch in die Zentrifuge und drehen Sie sie 15 Minuten lang bei 8.000 g. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt und in ein neues steriles Zentrifugenröhrchen überführt. Nach erneutem Zentrifugieren für 15 Minuten wird der Überstand vorsichtig abgesaugt und für die weitere Analyse verwendet. Stellen Sie eine sterile 0,22-Mikrometer-Filtereinheit auf Eis. Übertragen Sie den Überstand auf die Oberseite des Filters und schalten Sie die Vakuumpumpe ein, um die gefilterten Proben zu sammeln. Das Filtrat wird in einen Zentrifugalfilter mit einem Fassungsvermögen von 10 Kilodalton und einem Fassungsvermögen von 15 Millilitern überführt. Zentrifugieren Sie 30 Minuten lang bei 4 Grad Celsius 3000 g, um die Probe auf mindestens 1.400 Mikroliter zu konzentrieren. Legen Sie die Probe sofort auf Eis. Mischen Sie ein Volumen Gradientenpuffer A mit fünf Volumen Dichtegradientenmedium, um die Arbeitslösung herzustellen. Bereiten Sie eine 10%ige Iodixanollösung vor, indem Sie eine Einheit Arbeitslösung mit vier Einheiten Puffer B mischen. Mischen Sie in ähnlicher Weise zwei Einheiten Arbeitslösung mit drei Einheiten Puffer B für eine 20%ige Iodixanollösung und vier Einheiten Arbeitslösung mit einer Einheit Puffer B für eine 40%ige Iodixanollösung. Mischen Sie nun die zuvor vorbereitete konzentrierte Probe mit sieben Millilitern Dichtegradientenmedium, um eine 50%ige Iodixanollösung herzustellen. Um einen Dichtegradienten herzustellen, fügen Sie den 40%igen und 10%igen Iodixanollösungen Trypanblaulösung hinzu. Übertragen Sie acht Milliliter 50%ige Iodixanollösung auf den Boden eines dünnwandigen Zentrifugenröhrchens aus Polypropylen. Kippen Sie das Röhrchen um 70 Grad und geben Sie acht Milliliter 40%ige Iodixanollösung auf die Flüssigkeitsoberfläche. Fügen Sie als nächstes acht Milliliter 20%ige Iodixanollösung hinzu, gefolgt von sieben Millilitern 10%iger Iodixanollösung und zwei Millilitern endotoxinfreiem PBS. Nehmen Sie das vorbereitete Dichtegradientenröhrchen und legen Sie es in eine vorgekühlte Ultrazentrifuge. Stellen Sie die Ultrazentrifugationsparameter auf 100.000 G, 20 Stunden und 10 Grad Celsius ein und starten Sie den Lauf. Bei der manuellen Gradientendichtetrennung für die Sammlung beträgt der Dichtegradient etwa 34 Milliliter Flüssigkeit. Zwei Milliliter Lösung werden langsam aus der Mitte der Flüssigkeitsoberfläche extrahiert, und jede Zwei-Milliliter-Lösung ist ein Gradient. Die Lösung des Dichtegradienten wird also in 17 Gradienten unterteilt. Zum Schluss werden die Dichtefraktionen mit einer Pipette in sterile Probenröhrchen überführt und sofort auf Eis gelegt. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse zeigte die Größen-, Verteilungs- und Konzentrationsprofile extrazellulärer Vesikel, die aus verschiedenen Dichtegradientenfraktionen gesammelt wurden. Die Mehrzahl der extrazellulären Vesikel über alle Fraktionen hinweg war innerhalb des Größenbereichs von 30 bis 100 Nanometern konzentriert, wobei ein typisches Verteilungsmuster folgte. Die Konzentration extrazellulärer Vesikel erreichte ihren höchsten Wert in Fraktion neun und erreichte einen Spitzenwert von etwa 3,85 mal 10 hoch neun Partikeln pro Milliliter. Der Proteingehalt, gemessen mit einem Bicinchoninsäure-Kit, war mit 0,417 Mikrogramm pro Mikroliter auch in Fraktion neun am höchsten. Darüber hinaus waren die Expressionsniveaus der Lipopolysaccharide, die mit einem Endotoxin-Nachweiskit bestimmt wurden, in den Fraktionen neun und 10 signifikant erhöht. Größere Mengen an Protein wurden auch in Fraktion neun während der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Analyse beobachtet. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM-Bilder) zeigte, dass die extrazellulären Vesikel eine zirkuläre membranartige Morphologie besaßen.