Spektroskopische Superauflösungsbildgebung von DNA-Molekülen unter Verwendung von intrinsischem Kontrast

Unsere Forschung präsentiert das erste Protokoll zur Messung intrinsischer fluoreszierender Spektren von DNA-Molekülen, das die Untersuchung ihrer nativen optischen Eigenschaften und sequenzbezogenen Bestätigungsmerkmale ermöglicht. Dieses Protokoll nutzt endogene Fluoreszenz für die DNA-spektroskopische Bildgebung und vermeidet dabei markierende induzierte Störungen, Verknüpfungsfehler und inkonsistente markierte Dichte in bestehenden Methoden. Zu Beginn lösen Sie die DNA-Probe in nukleasefreiem, deionisiertem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 millimolaren auf.

Bereiten Sie fünf Mikroliter-Aliquoten der DNA-Bestandslösung vor, um wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu minimieren. Lagere die zusätzlichen Röhren mit der Grundlösung bei 4 Grad Celsius auf. Mit einem Labortuch reinigen Sie vorsichtig einen Glasobjektträger.

Pipettieren Sie fünf Mikroliter der 100-millimolaren DNA-Lösung auf den frisch gereinigten Glasträger und lassen Sie die Probe ein bis drei Stunden trocknen, um ein DNA-Gel zu bilden. In einer Abzughaube bereiten Sie entweder den Beta-Mercapptoethanol-Puffer oder den DABCO-Bildpuffer vor, um stochastisches Fotoswitching von DNA-Molekülen zu unterstützen. Pipettieren Sie fünf Mikroliter des Bildpuffers auf das DNA-Gel und legen Sie einen Deckmantel auf die Probe.

Wenn sich Blasen in der abgedeckten Probe befinden, verwenden Sie eine Pinzette, um sie zu entfernen. Erhalten Sie ein gefertigtes Nanoloch-Array mit Löchern mit einem Durchmesser von 100 Nanometern, die vier Mikrometer auseinander liegen und in acht Reihen und fünf Spalten angeordnet sind. Schalte das sSMLM-System ein und füge Filter mit schmaler Bandbreite direkt vor die Kamera ein.

Legen Sie die Kalibrierungsprobe unter ein Mikroskop und schalten Sie die Mikroskoplampe ein, um die Probe zu beleuchten. Stellen Sie die Belichtungszeit für alle Filter auf 200 Millisekunden ein, aber für den 750-Nanometer-Filter auf 2.000 Millisekunden. Gehe zur Erfassung und schneller Zeitraffer, um die Anzahl der Bilder pro Filter auf 10 anzupassen.

Nach der Kalibrierung werden die DNA-Gelprobe auf die Mikroskopstufe geladen, wobei die Abdeckungsseite zum Objektiv zeigt, und die Kamerasoftware zur Datenerfassung geöffnet. Identifizieren Sie die passende Z-Position mit dem automatischen Fokusverfolgungssystem und stellen Sie den Fokus an, bis klares stochastisches Blinken sichtbar ist. Stellen Sie sicher, dass das Objektiv die Deckelrutschkante nicht berührt, um ein Puffer-Leck ins Immersionsöl und eine Beeinträchtigung der Spur zu verhindern.

Nehmen Sie etwa 10.000 bis 30.000 Bilder mit der gewünschten Beleuchtungsleistung und einer Belichtungszeit von 30 Millisekunden auf. Nach der Datenerfassung erlauben Sie der Software, die Daten standardmäßig im nd2-Format zu speichern. Entsorgen Sie den Glasschlitten in einem zugelassenen Mülleimer, der für zerbrochenes Glas oder scharfe Gegenstände vorgesehen ist.

Entsorgen Sie alle verbleibenden Puffer gemäß den institutionellen Sicherheitsrichtlinien in den vorgesehenen chemischen Flüssigabfallbehälter. Öffnen Sie Fiji und verwenden Sie das Bioformats-Plugin, um den aufgenommenen Rohbildstapel der DNA-Probe zu laden. Wählen Sie das Bild gefolgt von Stacks, Z Project und wählen Sie die minimale Intensität als Projektionstyp, um die minimale Projektion des Raw-Bild-Stacks zu erzeugen.

Wählen Sie den Bildrechner aus und ziehen Sie die minimale Projektion vom Raw-Bildstapel ab. Speichere den im Hintergrund subtrahierten Datensatz als TIF-Datei für die spektrale Analyse. Als Nächstes führen Sie die Lokalisierungsidentifikation auf dem Null-Ordnung-RAW-Bildstack mit dem ThunderSTORM-Plugin Version 1.3 durch.

Setze den Schwellenwert auf das 1,2-fache der Standardabweichungswelle. F1, der den Radius auf drei und Sigma auf 1,5 anpasst, um das Bild der nullten Ordnung zu rekonstruieren und die Koordinaten des Emissionsereignisses zu extrahieren. Für den beschnittenen rohen Bildstapel der nullten Ordnung wählen Sie Plugin und anschließend ThunderSTORM aus und führen Sie die Analyse aus.

Verwenden Sie Fiji und die Open-Source-Software RainbowSTORM mit einer MATLAB-Version, die neuer als 2020b ist, um die Kalibrierungsdaten zu verarbeiten und die Beziehung zwischen horizontalen und vertikalen Verschiebungen und Wellenlängen zu erhalten. Führen Sie eine Lokalisierungsidentifikation auf den Kalibrierungsbildern der fünf Wellenlängen mit dem ThunderSTORM-Plugin durch. Stellen Sie die Schwelle auf das Fünffache der Standardabweichung ein, Welle.

F1, der den Radius auf drei anpasst, und Sigma auf 1,5, um Nanoloch-Lokalisierungen in der nullten Ordnung und entsprechende spektrale Lokalisierungen in der ersten Ordnung zu rekonstruieren. Erhalten Sie ein durchschnittliches Bild jeder Kalibrierungsdaten und passen Sie den Schwellenwert innerhalb eines Bereichs von fünf bis zehn Mal der Standardabweichungswelle an. F1 bis 80 Lokalisationen werden für jedes Kalibrierungsbild erhalten.

Führe den RainbowSTORM aus und klicke unter Spektralkalibrierung auf Durchsuchen, um die CSV-Dateien für jede Kalibrierungswellenlänge zu laden. Dann klicke auf Kalibrierungsdatei speichern, um die Kalibrierungsdatei zu speichern. Verwenden Sie das angepasste Python-Skript Version 3.11.7, um die Vollspektrumdaten zu extrahieren.

Dann setze die korrekten Dateipfade im Python-Skript für den Hintergrund-Subtratrahier-Stack im TIF-Format aus dem vorherigen Hintergrundsubtraktionsschritt. Stellen Sie den Dateipfad für die Lokalisierungs-CSV-Datei ein, die aus dem Lokalisierungsanalyseschritt erzeugt wird, und die Kalibrierungsdatei im MAT-Format, das aus dem Kalibrierungsschritt generiert wird. Dann stellen Sie die horizontale Verschiebung für die mit einem 3D-DWP erfassten 532-Nanometer-Daten entsprechend einem spektralen Fenster von 525 bis 750 Nanometern auf 925 bis 984 Pixel ein, um eine Abdeckung jenseits des Filterbereichs von 590 bis 650 Nanometern sicherzustellen.

Stellen Sie die vertikale Verschiebung sowohl für die mit dem 3D-DWP erfassten 488-Nanometer- als auch 532-Nanometer-Daten auf 23 Pixel an, basierend auf der mit RainbowSTORM erhaltenen spektralen Kalibrierungskurve. Schließlich wird das nichtlineare Spektrum mit einer Polynomanpassung dritter Ordnung für den späteren Vergleich und die Klassifikationsanalyse linearisiert. Die spektrale Kalibrierung wurde durchgeführt, wodurch die Messung der entsprechenden horizontalen und vertikalen Pixelverschiebungen zwischen der nullten Ordnung und den Bildern erster Ordnung ermöglicht werden konnte.

Dies ermöglichte die Abbildung einer Kalibrierungskurve zwischen der Pixelposition und der Wellenlänge. Die nichtlinearen und die umgewandelten linearen Emissionsspektren unter 532-Nanometer-Anregung wurden für GC-Alter gewonnen, was sich auf eine Art doppelsträngiges DNA-Molekül bezieht. Die grüne Kurve stellte das durchschnittliche Spektrum dar.

Die nichtlinearen und konvertierten linearen Emissionsspektren von A10C10, einer Art einzelsträngigem DNA-Molekül, wurden unter 488 Nanometer Anregung erhalten, wobei die blaue Kurve das durchschnittliche Spektrum darstellt. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, intrinsische fluoreszierende Spektren synthetisierter Einzel- und Doppelsträng-DNA-Moleküle mit spektroskopischer Superauflösungsbildgebung zu messen. Die genaue Lokalisierung der richtigen Z-Position ist entscheidend, da DNA-Gelproben keine strukturellen Informationen haben und sorgfältige Aufmerksamkeit erfordern, um die stochastischen Blinkungen zu beobachten.

Zukünftige Arbeiten können auf die Messung der intrinsischen Fluoreszenz von RNA und Protein ausgeweitet werden, wobei computergestützte Modelle zur Sequenzvorhersage und zur Markierung freier Chromatinbildgebung integriert werden.