Zugängliches Silikonchip-zu-Membran-Abdichtungsverfahren für flexible, zuverlässige Bindungen

Wir wollen eine Lücke im Organ-on-Chip-Design schließen und ein neues Abdichtungsverfahren für PDMS-Geräte mit poröser Membran bereitstellen. Derzeit ist das Abdichten von Chips schwierig, aber unser Prozess presst Silikon durch die Poren der Membran, sodass es nur mit Silikon-Silikon-Bindung zu tun hat. Wenn die Membran porös ist, wie zum Beispiel für eine Lunge oder einen Darm-auf-Chip, werden nur PDMS, Toluol und ein Vakuum benötigt.

Zunächst mischen Sie die flüssige PDMS-Basis gründlich mit dem Härtemittel in einem Verhältnis von 10 zu 1. Mit einer Vakuumkammer entfetten Sie das Gemisch, bis alle Luftblasen entfernt sind. Mit einer breiten Düsenspritze füllen Sie die zuvor vorbereiteten Formen mit dem entgasten PDMS-Gemisch.

Stellen Sie die gefüllten Formen in eine Vakuumkammer und entfetten Sie sie etwa 10 Minuten, bis alle Blasen entfernt sind. Mit einem Trockenofen die Formen zwei Stunden lang bei 65 Grad Celsius aushärten. Nach dem Aushärten werden die festen Spanhälften mit einem Skalpell aus den Formen entfernt.

Schneiden Sie die Verglasung an den Rändern jeder Chip-Hälfte ab. Dann wird mit einer Biopsie gestanzt, um vier Einlässe in die obere Hälfte an jedem Ende der Kammer und an den beiden benachbarten Ringen hinzuzufügen, die die Standorte der unteren Kammereinlasse anzeigen. Setzen Sie eine 3D-gedruckte Schablone über eine PET- oder PC-Membran.

Mit einem Skalpell schneiden Sie die Membran in Form und halten Sie die Schablone fest. Alternativ bereiten Sie eine extrahierte ECM-Membran vor und dehydrieren Sie sie. Legen Sie die Schablone über die Membran und schneiden Sie sie in Form, während Sie die Schablone festhalten.

Tragen Sie Schutzbrillen und Nitrilhandschuhe. Mische flüssiges PDMS mit Toluol im Verhältnis 7 zu 5, um den Mörser herzustellen. Mit einer Spritze mit breiter Düse verrühren Sie gründlich, indem Sie sie auf und ab spritzen, bis sie gleichmäßig ist.

Platzieren Sie alle Labormaterialien, die für den Umgang mit Toluol verwendet werden, 24 Stunden lang in eine Abzughaube, um die Verdunstung zu ermöglichen. Entsorgen Sie die Materialien in zugelassenen und gekennzeichneten Behältern über spezialisierte Abfalldienste. Verwenden Sie nun eine Pipettspitze, um den vorbereiteten PDMS-Mörtel schnell auf die Oberfläche der Chip-Hälfte aufzutragen, an der die Membran platziert wird.

Mit sauberer Pinzette halten Sie die vorbereitete Membran an einem Ende. Positionieren Sie die Membranspitze an der richtigen Stelle auf dem Nass-Mörtel und lassen Sie sie an ihren Platz fallen. Halte die Membran vorsichtig an Ort und Stelle.

Tragen Sie PDMS-Mörtel erneut auf die Membran auf und entfernen Sie sich bei jedem Schlag von der Kammer, um Blasen zu entfernen und die Membran zu sichern, ohne ihre Position zu verschieben. Geben Sie die membrangebundenen Chip-Hälften nach dem Mörtelauftragen sofort in eine Vakuumkammer und härten Sie sie 72 Stunden lang bei Raumtemperatur unter 25-Millibar-Vakuum aus. Schalten Sie die Vakuumpumpe, den Druckmodulator und den Plasmaofen ein.

Stellen Sie den Kammerdruck auf 320 Millibar ein. Dann werden sowohl die membrangebundene Chip-Hälfte als auch die zweite Chip-Hälfte für 30 Sekunden Sauerstoffplasmabehandlung hineingelegt. Nachdem die Chips aus der Vakuumkammer entfernt wurden, drücken Sie die beiden Hälften unter leichtem Handdruck schnell zusammen, um die Chipmontage abzuschließen.

PDMS-Mörtel, gefärbt mit Nilrot, wurde verwendet, um das Eindringen des flüssigen Mörtels in die 0,4-Mikrometer-Poren der PET- und PC-Membranen während der Vakuumversiegelung bei Raumtemperatur zu visualisieren. Bildgebung unter einem Lichtmikroskop zeigte, dass das Silikon erfolgreich in die Poren eingedrungen und die Oberfläche dünn beschichtet hatte. Extrazelluläre Matrixgerüste mit Basementmembranen binden ebenfalls erfolgreich im Chipgerät, was die breite Anwendbarkeit dieses Verfahrens zur Erreichung starker, flexibler Bindungen über verschiedene Membrantypen hinweg demonstriert.

Der Integritätstest der extrazellulären Matrixmembran zeigte, dass die Membran einen Millimeter zyklischer horizontaler Dehnung, die über Nacht durch Vakuum induziert wurde, standhielt. Um die Leistung des Chips als Airway-on-Chip für die Luft-Flüssigkeit-Schnittstellenzellkultur zu validieren, wurden menschliche Lungen-Calu-3-Epithelzellen bis zur Zusammenfluss und Luft im Gerät gezüchtet. Nach 10 Tagen apikaler Luftexposition differenzierten sich die Zellen zu schleimproduzierenden Zellen, wie die Alcian-Blaufärbung zeigt.

Wenn Epithelzellen mit Fibroblasten auf der extrazellulären Matrixmembran kokultiviert werden, bildeten die Epithelzellen eine konfluente Monoschicht auf der Innenseite, während Fibroblasten weniger dicht an der Außenoberfläche verteilt waren und eine spindelartige Morphologie beibehielten. Dieses Verfahren erleichtert die Herstellung von Organ-on-Chip-Geräten in den meisten Live-Umgebungen. Es ist sowohl für neue Entwickler als auch für einkommensschwache Labore zugänglich.

Epithelzellen können im Gerät an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche kultiviert, mit anderen Zelltypen kokultiviert werden, und ihre Barrierenintegrität kann leicht untersucht werden.