Name: confocal microscopy for protein localization
Uploaded: 2023-04-30T07:08:35.000Z
Duration: 13 min 13 s
Channel: JoVE

1. Materiales
Búferes
<ol><li>Tampón de lavado: 1 salina estéril con fosfato (PBS) sin calcio o magnesio</li>
	<li>Búfer de fijación: 1% paraformaldehído en PBS</li>
	<li>Búfer de permeabilización: 0.1% Triton X-100 en PBS</li>
	<li>Buffer de bloqueo: 1% albúmina sérica bovina en PBS</li>
	<li>Medio de crecimiento celular: DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), penicilina/estreptomicina y L-glutamina</li>
</ol>Equipo
<ol start="6"><li>Capucha de flujo laminar</li>
	<li>Incubadora humedecida (37oC, 5% CO2)</li>
	<li>Microscopio de escaneo láser confocal; aquí, Nikon Eclipse Ti láser</li>
</ol>Materiales y reactivos
<ol start="9"><li>Diapositivas de cultivo celular por cámara</li>
	<li>Medios de montaje anti-fade con DAPI (para tinción de núcleos)</li>
	<li>Vidrio de la cubierta del microscopio</li>
	<li>Toallitas de tarea delicadas</li>
	<li>Pipettors y puntas</li>
</ol>Reactivos específicos de ensayo
<ol start="14"><li>Células adherentes (células primarias o líneas celulares); aquí, se utilizaron fibroblastos de ratón transtrófilos con CD1d (LCD1).</li>
	<li>Anticuerpos primarios para detectar objetivos celulares; aquí, se utilizaron cd107a antiratón de rata (LAMP-1) y ratón antiratón CD1d.</li>
	<li>Anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos específicos de los isotipos de anticuerpos primarios; aquí se utilizaron IgG anti-rata conjugada con Alexafluor 488 y anti-ratón IgG conjugado con Alexafluor 647.</li>
</ol>2. Protocolo
Preparación para la tinción de anticuerpos
Células de sembrado
<ol><li>Resuspender las células de interés en los medios de crecimiento.</li>
	<li>Luego, la semilla de 500 l de la suspensión de la célula / por pozo en los pozos de un portaobjetos de cámara de 4 pozos. (Aquí, las células LCD1 se sembraron a 2.5x105 células/cámara en 500 s de medios de crecimiento. La densidad de sembración puede variar entre líneas celulares).</li>
	<li>Incubar el tobogán de la cámara durante la noche en una incubadora deCO2 del 5% a 37oC, para permitir que las células se adhieran al vidrio.</li>
	<li>Al día siguiente, aspirar los medios de cada poca y luego lavar las células 1X con 500 l de PBS.</li>
</ol>Fijación
<ol start="5"><li>Para fijar las células, agregue una solución de paraformaldehído de 500 l 1% en cada poca y incubadurante durante 15 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de la incubación, recoja el paraformaldehído en un contenedor de residuos líquidos peligrosos apropiado.</li>
	<li>Luego, lave las células 3 veces con 500 l de PBS para eliminar los restos del fijador.</li>
</ol>Permeabilización
<ol start="8"><li>Permeabilizar las células incubando con un tampón/bien de permeabilización de 500 l durante 15 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Luego, lave las células brevemente 3 veces con 500 l de PBS.</li>
</ol>Bloqueo
<ol start="10"><li>Incubar las células de cada pozo con un tampón de bloqueo de 500 ml durante 1 hora a 4oC, para bloquear la unión de anticuerpos no específicos.</li>
</ol>Incubación de anticuerpos primarios
<ol start="11"><li>Aspirar el búfer de bloqueo de las cámaras deslizantes.</li>
	<li>A continuación, agregue 500 s de solución de anticuerpos primarios diluidas a las células. (Aquí, anti-CD107a (LAMP-1) se diluyó 1:500 y anti-CD1d se utilizó sin diluir (1H6 anticuerpo monoclonal fue amablemente proporcionado por el Dr. Randy Brutkiewicz)).</li>
	<li>Incubar los toboganes durante la noche a 4oC.</li>
</ol>Nota: Si sondea más de un objetivo, asegúrese de que los anticuerpos primarios sean isotipos diferentes. Las concentraciones recomendadas de anticuerpos varían entre los fabricantes y deben valorarse antes de su uso.
Incubación Secundaria de Anticuerpos
<ol start="14"><li>Aspirar la solución primaria de anticuerpos de los pozos.</li>
	<li>Lave las cámaras del pozo 4 veces con 500 oL de PBS.</li>
	<li>A continuación, añadir 500 s de la solución de anticuerpos secundarios diluidas a cada poca. (Aquí, tanto los anticuerpos secundarios- anti-ratón IgG Alexafluor 647 y anti-rata IgG Alexafluor 488 se diluyeron 1:2000 en el búfer de bloqueo).</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad.</li>
	<li>Después de la incubación, aspirar la solución secundaria de anticuerpos.</li>
	<li>Lavar las cámaras 4 veces con 500 oL de PBS para eliminar cualquier anticuerpo secundario no unido.</li>
</ol>Nota: Las concentraciones recomendadas de anticuerpos varían entre los fabricantes y deben valorarse antes de su uso. Si se sondea más de un objetivo, los anticuerpos secundarios deben conjugarse con diferentes fluoróforos con espectros únicos de excitación/emisión. También tenga en cuenta la excitación/emisión de la contramancha nuclear (es decir, DAPI) mientras selecciona los fluoróforos. La selección de fluoróforos puede verse afectada por la configuración láser del microscopio confocal utilizado. La configuración láser de la máquina dictará qué fluoróforos son adecuados para el experimento.
3. Montaje de Coverslips
<ol><li>En primer lugar, retire cuidadosamente las cámaras de la corredera.</li>
	<li>Luego, sostenga la diapositiva en ángulo sobre una delicada limpieza de tareas y retire el líquido de los bordes sin tocar las células.</li>
	<li>Agregue 1 gota de medio de montaje antidescoloro, que contenga la mancha nuclear DAPI, en cada sección de las células.</li>
	<li>A continuación, coloque un recubre de 20 mm x 60 mm sobre la diapositiva sosteniéndolo sobre los bordes con las yemas de los dedos. (Evite la formación de burbujas sobre las células, ya que interfieren con las imágenes).</li>
	<li>Limpie cualquier medio de montaje adicional en los lados con una delicada limpieza de tareas y guarde los portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente hasta una semana.</li>
</ol>4. Imágenes confocales
Muestras de imagen en un microscopio de escaneo láser confocal. Para los datos mostrados en la Figura 2, la Nikon Eclipse Ti A1R se utilizó con el software NIS Elements Advanced Research. En la siguiente sección se detalla el procedimiento para capturar imágenes utilizando el software antes mencionado.
<ol><li>Para comenzar a crear imágenes de las celdas, abra el software 'NIS Elements Advanced Research' haciendo clic en el icono de'NIS software.'</li>
	<li>A continuación, en la ventana de control haga clic en 'TiPad' pestaña y elegir el objetivo deseado para la imagen. (Aquí, se utilizó el primer objetivo 40x).</li>
	<li>Cargue la diapositiva con celdas en el escenario y céndala debajo de la lente.</li>
	<li>Ahora, en la pestaña 'A1plus Compact GUI', configure los láseres apropiados para los fluoróforos utilizados. Haga clic en el símbolo de engranaje para abrir el menú de ajustes espectrales y de tinte y seleccionar los canales necesarios y configurar el láser para cada canal.</li>
	<li>A continuación, seleccione las emisiones apropiadas en el menú desplegable bajo el primer espejo dicroico.</li>
	<li>A continuación, en 'A1plus Compact GUI' ventana, haga clic en 'Ch. Series' para configurar la serie de canales de línea, que configura si los láseres utilizados se disparará en la muestra simultáneamente o secuencialmente. (Aquí, se eligieron pasadas secuenciales, comenzando con el canal 1, seguido por el canal 2, luego 4).</li>
	<li>Después de eso, comience a escanear haciendo clic en el icono ' Punta deflecha' en la parte superior. En este punto mientras la imagen está en vivo, bajo 'A1plus Compact GUI' ventana, haga clic en la escala deslizante y modificar el tamaño del agujero para asegurar la limitación de la luz de enfoque. (Aquí, se utilizó el ajuste más bajo disponible (0,5).</li>
	<li>A continuación, ajuste los ajustes 'alto voltaje' y 'offset' bajo cada láser a los niveles apropiados, mediante el uso de las escalas deslizantes para permitir la detección de la tinción específica mientras se limita cualquier posible tinción de fondo. Si hay disponible una muestra de tinción positiva, comience por tomar imágenes de esta muestra para cada canal para asegurarse de que los ajustes del láser producen proporciones óptimas de señal a ruido. Precaución: la alta intensidad del láser durante períodos prolongados puede causar fotoblanqueo.
</li>
	<li>Después de establecer los valores óptimos de HV y desplazamiento para cada láser, haga clic en la pestaña 'ND Acquisition' y luego seleccione el icono 'Z' para configurar los parámetros para la serie z. A continuación, mientras se adquiere una imagen en vivo de la muestra, primero establezca la parte inferior encontrando la parte inferior de la imagen y haciendo clic en el botón 'inferior' luego encontrar la posición superior de la muestra y haga clic en el botón 'superior'. Establezca el tamaño del paso escribiendo específicamente el tamaño de paso preferido en el valor de m para cada paso o especificando cuántos pasos totales se necesitan.</li>
	<li>Una vez establecidos los parámetros de la serie z, seleccione la resolución de tamaño/píxel deseada de la imagen. Para ello, haga clic en la ventana 'A1plus Compact GUI' y debajo del icono 'size' seleccione la resolución deseada. Para disminuir el ruido de la imagen, se puede seleccionar el menú desplegable junto al símbolo 'á' para promediar el número seleccionado de imágenes.</li>
	<li>Ahora, haga clic en la pestaña'Ejecutar ahora' en el menú 'Nd Acquisition' para comenzar a tomar imágenes de la muestra.</li>
	<li>Una vez completada la imagen, guarde la imagen haciendo clic en 'Archivo', luego 'Guardar como', que exportará el archivo de imagen con la extensión '.nd2'. Por último, repita el proceso para cada una de las otras muestras.</li>
</ol>

La tinción fluorescente confocal es un procedimiento relativamente simple que da como resultado imágenes de muestras de muy alta calidad que se preparan de una manera similar a la de la microscopía de fluorescencia convencional. En resumen, las muestras se fijan, se permeabilizan y luego se bloquean. Se permite que los anticuerpos primarios contra una proteína o proteínas de interés se unan, y luego se utilizan anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos para visualizar la tinción. La microscopía de fluorescencia ...

microscopía de fluorescencia confocal: una técnica para determinar la localización de proteínas en fibroblastos de ratón

Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

Fuente: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1 1 Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland y el Centro Integral del Cáncer Marlene y Stewart Greenebaum, Baltimore, Maryland 21201 2 Centro de Ingeniería y Tecnología Biomédica, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland, Baltimore, Maryland 21201
La microscopía de fluorescencia confocal es una técnica de imagen que permite una mayor resolución óptica en comparación con la microscopía de epifluorescencia convencional de "campo ancho". Los microscopios confocales son capaces de lograr una resolución óptica x-y mejorada a través del "escaneo láser", normalmente un conjunto de espejos controlados por voltaje (galvanómetro o espejos "galvo") que dirigen la iluminación láser a cada píxel de la muestra a la vez. Lo que es más importante, los microscopios confocales logran una resolución z-axial superior mediante el uso de un agujero para eliminar la luz de foco procedente de lugares que no están en el plano z que se está escaneando, lo que permite al detector recopilar datos de un plano z especificado. Debido a la alta resolución z alcanzable en la microscopía confocal, es posible recopilar imágenes de una serie de planos z (también llamados z-stack) y construir una imagen 3D a través de software.
Antes de discutir el mecanismo de un microscopio confocal, es importante considerar cómo interactúa una muestra con la luz. La luz se compone de fotones, paquetes de energía electromagnética. Un fotón que afecta a una muestra biológica puede interactuar con las moléculas que componen la muestra de una de cuatro maneras: 1) el fotón no interactúa y pasa a través de la muestra; 2) el fotón se refleja / dispersa; 3) el fotón es absorbido por una molécula y la energía absorbida se libera como calor a través de procesos conocidos colectivamente como descomposición no radiativa; y 4) el fotón se absorbe y la energía se emite rápidamente como un fotón secundario a través del proceso conocido como fluorescencia. Una molécula cuya estructura permite la emisión de fluorescencia se llama fluoróforo. La mayoría de las muestras biológicas contienen fluoróforos endógenos insignificantes; por lo tanto, los fluoróforos exógenos deben utilizarse para resaltar las características de interés en la muestra. Durante la microscopía de fluorescencia, la muestra se ilumina con luz de la longitud de onda adecuada para la absorción por el fluoróforo. Al absorber un fotón, se dice que un fluoróforo está "emocionado" y el proceso de absorción se conoce como "excitación". Cuando un fluoróforo renuncia a la energía en forma de fotón, el proceso se conoce como "emisión", y el fotón emitido se llama fluorescencia.
El haz de luz utilizado para excitar un fluoróforo está enfocado por la lente objetivo de un microscopio y converge en un "punto focal" donde se centra al máximo. Más allá del punto focal, la luz vuelve a divergir. Las vigas de entrada y salida se pueden visualizar como un par de conos que se tocan en el punto focal (consulte la figura 1, panel izquierdo). El fenómeno de la difracción impone un límite a la tensión con la que se puede enfocar un haz de luz : el haz en realidad se centra en un punto de tamaño finito. Dos factores determinan el tamaño del punto focal: 1) la longitud de onda de la luz, y 2) la capacidad de recolección de luz de la lente objetivo, que se caracteriza por su apertura numérica (NA). El "punto" focal se extiende no sólo en el plano x-y, sino también en la dirección z, y en realidad es un volumen focal. Las dimensiones de este volumen focal definen la resolución máxima alcanzable por imágenes ópticas. Aunque el número de fotones es mayor dentro del volumen focal, las trayectorias de luz cónicas por encima y por debajo del foco también contienen una densidad más baja de fotones. Cualquier fluoróforo en el camino de luz puede ser excitado. En la microscopía de epifluorescencia convencional (de campo ancho), la emisión de fluoróforos por encima y por debajo del plano focal contribuye a la fluorescencia fuera de foco (un "fondo de superficie"), que reduce la resolución y el contraste de la imagen, como se demuestra en la Figura 1, con el cubo rojo que representa la emisión de fluoróforo por encima del plano focal (estrella roja) que resulta en fluorescencia desenfocada (arriba a la derecha). Este problema se mejora en microscopía confocal, debido a la utilización de un agujero. (Figura 2, abajo a la derecha). Como se muestra en la Figura 3, el agujero permite que las emisiones procedentes del lugar focal lleguen al detector (izquierda), al tiempo que bloquea la fluorescencia desenfocada (derecha) de llegar al detector, mejorando así tanto la resolución como el contraste.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig1.jpg"> Figura 1. Resolución óptica de epifluorescencia frente a microscopía confocal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El haz de luz utilizado para excitar un fluoróforo está enfocado por la lente objetivo de un microscopio y converge en un volumen focal y luego diverge (izquierda). La estrella roja representa el plano focal de una muestra que se está siendo imagenda mientras que el cuadrado rojo representa la emisión de fluoróforo por encima del plano focal. Al capturar una imagen de esta muestra utilizando un microscopio epifluorescente, la emisión desde el cuadrado rojo fuera de foco será visible y contribuirá a un "fondo brumoso" (arriba a la derecha). Los microscopios confocales tienen un agujero que impide la detección de la luz emitida fuera del plano focal, eliminando el "fondo brumoso" (abajo a la derecha).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig2.jpg"> Figura 2. Efecto agujero en microscopía confocal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Aunque la intensidad más alta de la luz de excitación se encuentra en el punto focal de la lente (izquierda, óvalo rojo), otras partes de la muestra que no están en el punto focal (derecha, estrella roja) obtendrán luz y flúor. Para evitar que la luz emitida por estas regiones fuera de foco llegue al detector, hay una pantalla con un agujero delante del detector. Sólo la luz de enfoque (izquierda) que emite desde el plano focal es capaz de viajar a través del agujero y llegar al detector. La luz desenfocada (derecha) está bloqueada con el agujero y no llega al detector.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig3.jpg"> Figura 3. Componentes principales de un microscopio de escaneo láser confocal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En aras de la simplicidad, la descripción mecanicista de un microscopio confocal se limitará a la de la Nikon Eclipse Ti A1R. Aunque puede haber pequeñas diferencias técnicas entre diferentes microscopios confocales, el A1R sirve bien como un buen modelo para describir la función del microscopio confocal. El haz de luz de excitación, producido por una serie de láseres de diodos, se refleja en el espejo dicrosico primario en el objetivo, que centra la luz en la muestra que se está realizando. El espejo dicoico primario refleja selectivamente la luz de excitación mientras permite que la luz en otras longitudes de onda pase a través. A continuación, la luz se encuentra con los espejos de escaneo que barren el haz de luz a través de la muestra de una manera x-y, iluminando un solo píxel (x,y) a la vez. La fluorescencia emitida por los fluoróforos en el píxel iluminado es recogida por la lente objetivo y pasa a través del espejo dicrromico primario para llegar a una serie de tubos fotomultiplicadores (PMP). Los espejos dicoicos secundarios dirigen la luz de emisión a la PMT apropiada. La luz de excitación dispersa por la muestra de nuevo en el objetivo se refleja en el espejo dicroro primario hacia la muestra, y así se impide que entre en la detección camino de luz y alcanzando los PMT (véase el cuadro 3). Esto permite cuantificar la fluorescencia relativamente débil sin contaminación por la luz dispersa del haz de luz de excitación, que suele ser órdenes de magnitud más intensas que la fluorescencia. Debido a que el agujero bloquea la luz desde fuera del volumen focal, la luz que llega al detector proviene de un plano zestrecho y seleccionado. Por lo tanto, las imágenes se pueden recoger de una serie de planos zadyacentes; esta serie de imágenes se conoce a menudo como una 'z-pila'. Mediante el uso del software adecuado, se puede procesar una z-stack para generar una imagen 3D de la muestra. Una ventaja particular de la microscopía confocal es la capacidad de distinguir la localización subcelular de la tinción. Por ejemplo, la diferenciación entre la tinción de membrana de la tinción intracelular, que es muy difícil con la microscopía de epifluorescencia convencional (1, 2, 3).
La preparación de muestras es una faceta importante de las imágenes confocales. Una fuerza de las técnicas de microscopía óptica es la flexibilidad para crear imágenes de células vivas o fijas. Al intentar producir imágenes 3D, debido al número de imágenes que se deben adquirir para una pila z, la dificultad de mantener la salud celular, y el movimiento de las células vivas y sus orgánulos, el uso de células fijas es típico. El procedimiento de fijación y tinción de células para fluorescencia confocal es similar al utilizado convencionalmente en inmunofluorescencia. Después del cultivo en diapositivas de cámara o en cubreobjetos, las células se fijan usando paraformaldehyde para preservar la morfología celular. La unión de anticuerpos no específica se bloquea mediante albúmina de suero bovino, leche o suero normal. Con el fin de mantener la especificidad de los anticuerpos secundarios, la solución utilizada no debe proceder de la misma especie en la que se generaron los anticuerpos primarios. Las células se incuban con anticuerpos primarios que unen el antígeno de interés. Al etiquetar varios objetivos celulares, los anticuerpos primarios deben derivarse cada uno de una especie diferente. Los anticuerpos que etiqueten un antígeno están unidos por anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos. Se deben seleccionar anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos para que sean compatibles con las longitudes de onda de excitación láser disponibles en el microscopio confocal. Al visualizar múltiples antígenos, los espectros de excitación/emisión de los fluoróforos deben diferir lo suficiente para que sus señales puedan ser discriminadas por análisis microscópicos. La muestra manchada se monta en un portaobjetos para obtener imágenes. Se utiliza un medio de montaje para prevenir el fotoblanqueo y la deshidratación de muestras. Si lo desea, se puede utilizar un medio de montaje que contenga una contramancha nuclear (por ejemplo, DAPI o Hoechst) (4).
En el siguiente protocolo, los fibroblastos de ratón transinfectados para expresar CD1d (LCD1) se tiñieron con anticuerpos que reconocieron CD1d y CD107a (LAMP-1). CD1d es un importante complejo de histocompatibilidad 1 (MHC 1) -como receptor presente en la superficie del antígeno que presenta antígenos lipídicos. LAMP-1 (proteína de membrana asociada a la islosomal-1) es una proteína transmembrana presente principalmente en las membranas lisosomal. Para una correcta presentación del antígeno, CD1d se trafica a través del compartimento lisosomal de pH bajo, por lo que LAMP-1 se utiliza como marcador del compartimento lisosomal para este protocolo. Al sondear las células LCD1 con anti-CD1d y anti- LAMP-1 que se produjeron en diferentes especies, se pueden utilizar anticuerpos secundarios con fluoróforos únicos para determinar la localización de cada proteína en la célula y si CD1d está presente en el LAMP-1 positivo compartimentos lisosomal.

En este experimento, los fibroblastos de ratón que expresaban el gen de la glicoproteína superficial CD1d fueron fijos, inmunomanchados e imágenes en un microscopio confocal. Una imagen representativa obtenida usando el protocolo antedicho se muestra en la Figura 4. En el panel superior de A, se presentan imágenes de un solo canal que muestran el patrón de tinción de cada objetivo individual. Estas imágenes comprenden una sola sección (rebanada) de la pila z capturada. El panel derecho mu...

Microscopía de Fluorescencia Confocal: Una Técnica para Determinar la Localización de Proteínas en Fibroblastos de Ratón

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine ...

La microscopía de fluorescencia confocal es una técnica de imagen especializada para la localización de una proteína o antígeno de interés en una muestra de célula o tejido mediante el marcaje del antígeno con un tinte fluorescente conjugado con anticuerpos y la detección de la señal fluorescente. Ofrece una mayor resolución espacial que la microscopía de fluorescencia de campo amplio, con la ayuda de dos orificios colocados en los planos focales de la lente del objetivo, lo que le da el nombre de confocal. Permite a los usuarios visualizar la tinción a nivel subcelular, como la diferenciación entre la tinción de la membrana superficial y la tinción intracelular. Un microscopio confocal sigue un principio básico similar al de un microscopio de fluorescencia clásico. El haz de una fuente de luz, generalmente un láser para confocal, es reflejado por un espejo dicroico y enfocado por una lente objetivo en la muestra. Esta luz excita los fluoróforos para que emitan una longitud de onda diferente, que viaja de regreso a través de la lente del objetivo y el espejo dicroico a una cámara o ocular. La resolución mejorada de un microscopio confocal se debe principalmente a la presencia de dos orificios, que son orificios muy pequeños para que la luz pase a través de ellos en las trayectorias de excitación y emisión de luz. Los orificios están colocados estratégicamente en el plano focal de la lente del objetivo. Ahora, cambiemos a un esquema de vista lateral de la disposición del microscopio para revisar la trayectoria de la luz. Después de pasar a través del orificio de excitación, el haz de luz de excitación tiene el efecto de originarse en un punto focal, lo que permite que la lente del objetivo también enfoque la luz en un punto de la muestra. El haz de emisión de este punto focal converge en el orificio de emisión, lo que le permite pasar. Ahora, durante la excitación, los fluoróforos dentro de la trayectoria de la luz, por encima y por debajo del punto focal, también se excitan ligeramente. Mientras que la luz de emisión que se origina en el punto focal pasa a través del agujero de alfiler, las emisiones de los puntos desenfocados convergen antes o después del agujero de emisión, y por lo tanto se bloquean, lo que resulta en una fluorescencia de fondo reducida. El ciclo de excitación-emisión-detección debe repetirse para cada punto de imagen en la región de interés, lo que se puede hacer de diferentes maneras. Por ejemplo, el escaneo láser confocal utiliza espejos de escaneo de galvanómetro, que desvían la luz de excitación en diferentes ángulos. Por lo tanto, barre el haz de luz a través de la muestra en el plano XY. El disco giratorio confocal utiliza un disco con una matriz de orificios, que gira para cambiar la disposición de los orificios. Esto permite a los usuarios iluminar múltiples puntos pequeños de imagen en la muestra cada vez, cubriendo gradualmente toda el área a medida que gira el disco. Como resultado de los agujeros de alfiler, la imagen XY en el detector representa un plano Z estrecho. Por lo tanto, las imágenes se pueden recopilar de una serie de planos Z consecutivos, a menudo denominados pila Z. A partir de estas imágenes, un software adecuado puede generar una representación en 3D del patrón de señal de fluorescencia en la muestra. En este protocolo, observará la inmunotinción de fibroblastos de ratón, seguida de imágenes en un microscopio confocal para visualizar diferencialmente una proteína de la superficie celular y una proteína lisosomal. Para comenzar, utilizando técnicas estériles, resuspenda las células de interés en 500 microlitros de medio de crecimiento por pocillo y luego siembrójelas en los pocillos de un portaobjetos de cámara de cuatro pocillos. Aquí, estamos utilizando fibroblastos de ratón que fueron transfectados para expresar la molécula presentadora de antígeno, CD1d. Para permitir que las células se adhieran al vidrio, coloque el portaobjetos de la cámara en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados e incube durante la noche. Por la mañana, aspire los medios de cada pocillo y luego lave las células una vez con 500 microlitros de PBS durante unos segundos. Para fijar las celdas, agregue 500 microlitros de solución de paraformaldehído al 1% en cada pocillo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, recoja el paraformaldehído en un contenedor de desechos líquidos peligrosos apropiado y luego elimine cualquier resto del fijador lavando las celdas tres veces con PBS durante unos segundos. Para permitir la penetración de los anticuerpos en las células, añadir 500 microlitros de tampón de permeabilización a cada pocillo e incubar en el banco durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la permeabilización, lavar las células brevemente tres veces con 500 microlitros de PBS. A continuación, añada 500 microlitros de tampón de bloqueo a cada pocillo e incube durante una hora a cuatro grados centígrados para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos. Prepare los anticuerpos primarios, anti-CD1d y anti-LAMP-1, en concentraciones de trabajo adecuadas. A continuación, aspire el tampón de los pocillos y cubra las células de cada pocillo con 500 microlitros de solución de anticuerpos primarios diluidos y, a continuación, incube el portaobjetos sobre una superficie plana durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, diluya los anticuerpos secundarios, en este caso un anticuerpo anti-ratón y anti-rata con marcas fluorescentes distintas, en tampón de bloqueo a concentraciones de trabajo adecuadas. A continuación, aspire la solución de anticuerpos primarios de los pocillos y luego lave las células cuatro veces con 500 microlitros de PBS. A continuación, añada 500 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios diluidos a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad. Después de la incubación, aspire la solución de anticuerpos secundarios y lave los pocillos cuatro veces con 500 microlitros de PBS para eliminar cualquier anticuerpo secundario no unido. Para montar las muestras después del lavado final, separe y retire con cuidado las cámaras del portaobjetos. Para eliminar el PBS residual, sostenga el portaobjetos en ángulo sobre una toallita delicada y elimine el líquido de los bordes sin tocar las celdas. Una vez eliminado el exceso de PBS, se añade una gota de medio de montaje antidecoloración, que contenga el DAPI de tinción nuclear, en cada sección de las células. A continuación, tome un cubreobjetos de 20 por 60 milímetros y, con las yemas de los dedos, comience a bajar el cubreobjetos lentamente en cada borde, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas sobre las celdas. Limpie cualquier medio de montaje adicional en las guías con una toallita de trabajo delicada y guarde las guías en la oscuridad a temperatura ambiente hasta por una semana. Para comenzar a obtener imágenes de las celdas, primero haga clic en el icono del software NIS en el escritorio. Una vez en la ventana de control, haga clic en la pestaña TiPad en la parte superior y elija el objetivo deseado para la imagen. A continuación, cargue la diapositiva con celdas en el escenario y céntrela debajo de la lente. A continuación, en la pestaña A1plus Compact GUI junto a la pestaña TiPad, configure los láseres apropiados para los fluoróforos utilizados. Haga clic en el símbolo del engranaje para abrir el menú de configuración de tinte y espectral. Una vez que el menú de configuración de tinte y espectral esté abierto, seleccione los canales necesarios y configure el láser para cada canal. A continuación, seleccione las emisiones adecuadas en el menú desplegable situado debajo del primer espejo dicroico. A continuación, en la ventana de la GUI compacta A1plus, haga clic en Ch.Series para configurar la serie de canales de línea, que establece si los láseres utilizados dispararán sobre la muestra de forma simultánea o secuencial. Después de eso, comience a escanear haciendo clic en el icono de la punta de la flecha en la parte superior. En este punto, mientras la imagen está en vivo, en la ventana de A1plus Compact GUI, haga clic en la escala deslizante y modifique el tamaño del agujero para asegurarse de limitar la luz desenfocada. A continuación, ajuste la configuración de alto voltaje y compensación debajo de cada láser a los niveles apropiados mediante el uso de las escalas deslizantes para permitir la detección de la tinción específica y limitar cualquier posible tinción de fondo. Si se dispone de una muestra de tinción positiva, comience por obtener imágenes de esta muestra para cada canal para asegurarse de que los ajustes del láser produzcan una relación señal-ruido óptima. Después de establecer los valores óptimos de HV y offset para cada láser, haga clic en la pestaña ND Acquisition y, a continuación, seleccione el icono Z para configurar los parámetros de la serie z. A continuación, mientras adquiere una imagen en vivo de la muestra, primero establezca la parte inferior encontrando la parte inferior de la imagen y haciendo clic en el botón inferior. A continuación, busque la posición superior de la muestra y haga clic en el botón superior. Establezca el tamaño del paso escribiendo específicamente el tamaño de paso preferido en micras para cada paso o especificando cuántos pasos totales se necesitan. Para seleccionar el tamaño/resolución de píxeles deseado de la imagen, haga clic en la ventana de la GUI de Aiplus Compact y, debajo del icono de tamaño, seleccione la resolución deseada. Para disminuir el ruido de la imagen, puede seleccionar el menú desplegable junto al símbolo theta para promediar el número seleccionado de imágenes. Después de esto, haga clic en la pestaña Ejecutar ahora en el menú Adquisición de ND para comenzar a crear imágenes de la muestra. Una vez completada la imagen, guarde la imagen haciendo clic en archivo y, a continuación, en Guardar como, lo que exportará el archivo de imagen con la extensión dot-nd2. Finalmente, repita el proceso para cada una de las otras muestras. En este experimento, los fibroblastos de ratón que expresan el gen de la glicoproteína de superficie CD1d se fijaron, inmunotiñeron y obtuvieron imágenes en un microscopio confocal. Esta imagen muestra una sola sección de una pila Z con un aumento de 40X, donde CD1d está teñido de rojo. La muestra se cubrió con LAMP-1, un marcador lisosomal, en color verde. Se utilizó la tinción nuclear DAPI para mostrar los núcleos de las células. En una imagen compuesta en la que se fusionan los tres canales diferentes, la apariencia de amarillo es el resultado de la superposición de los canales rojo y verde, e indica un área donde CD1d y LAMP-1 se localizan conjuntamente en los lisosomas. Las áreas en las que solo hay un color indican la presencia de CD1d o LAMP-1 sin colocalización. Esta imagen muestra una representación en 3D de las celdas construidas a partir de imágenes capturadas en la pila z y este método permitió la construcción de una vista lateral de este grupo de celdas. La siguiente imagen muestra un corte de la pila z con un aumento de 100X, lo que demuestra los patrones de expresión de estas dos proteínas con mayor detalle. El cuadro delineado de color rosa en el lado derecho de la imagen muestra la sección transversal de la coordenada x designada por la línea rosa de la imagen, que representa la vista lateral en la línea rosa. De manera similar, el cuadro con contorno azul en la parte inferior de la imagen muestra la sección transversal de la coordenada y designada por la línea azul en la imagen, que representa la vista frontal en la línea azul. La representación en 3D de la imagen de la pila z permite a los usuarios ver la imagen en 3D, visualizando todos los planos x, y y z. Esto se puede utilizar para estudiar la colocalización de las diferentes tinciones en diferentes regiones dentro de la célula.

confocal-fluorescence-microscopy-technique-to-determine-localization

Education

Educación

JoVE Science Education

Advanced Biology

Biología Avanzada

Immunology

Inmunología

confocal microscopy for protein localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell.

The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a molecule that can fluoresce. Because most biological samples have very little natural fluorescence, researchers usually add fluorescent labels to highlight the structures they want to study.

A confocal microscope focuses light into a small focal volume, not just a single point in the x-y plane. The size of that volume depends on the wavelength of light and the numerical aperture, or NA, of the objective lens. Light above and below the focal plane can still excite fluorophores, but the pinhole removes most of the unwanted emission before it reaches the detector.

Compared with conventional epifluorescence microscopy, this design reduces the hazy background caused by out-of-focus fluorescence. The result is sharper images and better contrast. Confocal microscopy also allows collection of images from a series of z-planes, called a z-stack, which can be processed into a 3D image with software.

The microscope described in the protocol uses diode lasers, a primary dichroic mirror, scanning mirrors, and photomultiplier tubes, or PMTs. The dichroic mirror reflects the excitation light into the objective while letting other wavelengths pass through. The scanning mirrors move the beam across the sample one pixel at a time, and the PMTs detect the emitted fluorescence. The pinhole and optical path also help keep scattered excitation light out of the detector so the weaker fluorescence signal can be measured more clearly.

One major advantage of confocal imaging is that it can separate membrane staining from intracellular staining more clearly than wide-field methods. This is useful when studying where a protein is found inside a cell. It is especially helpful when a 3D view is needed from a z-stack.

Preparing the sample is an important part of the process. For 3D imaging, fixed cells are often used because live cells can move and are harder to keep healthy while many z-planes are collected. Cells are grown on chamber slides or coverslips, fixed with paraformaldehyde, and blocked with bovine serum albumin, milk, or normal serum to reduce nonspecific antibody binding. The blocking solution should not come from the same species used to make the primary antibodies.

Next, the cells are stained with primary antibodies that bind the target antigen. If several targets are being labeled, each primary antibody must come from a different species. Fluorophore-conjugated secondary antibodies then bind the primary antibodies. Their excitation and emission properties must match the lasers on the confocal microscope, and the fluorophores should be different enough that the signals can be separated. A mounting medium is used to protect the sample from photobleaching and drying, and it may include a nuclear counterstain such as DAPI or Hoechst.

In the protocol shown here, mouse fibroblasts were made to express CD1d and were stained for CD1d and CD107a, also called LAMP-1. CD1d is a major histocompatibility complex 1, or MHC 1, like receptor that presents lipid antigens on antigen-presenting cells. LAMP-1 is a transmembrane protein found mainly in lysosomal membranes and serves as a marker for the lysosomal compartment. Because CD1d must travel through this low-pH compartment for proper antigen presentation, confocal imaging can show whether CD1d is present in LAMP-1-positive lysosomes.

Confocal Microscopy for Protein Localization

confocal-microscopy-for-protein-localization

flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

flow-cytometry-fluorescence-activated-cell-sorting-facs-isolation

Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

magnetic-activated-cell-sorting-macs-isolation-of-thymic-t-lymphocytes

Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

elispot-assay-detection-of-ifn-secreting-splenocytes

ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

antibody-generation-producing-monoclonal-antibodies-using-hybridomas

Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

immunofluorescence-microscopy-immunofluorescence-staining-paraffin

Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

cell-cycle-analysis-assessing-cd4-cd8-t-cell-proliferation-after

Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host

Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

assay-for-cell-death-chromium-release-assay-of-cytotoxic-ability

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

Esta colección incluye diversas técnicas básicas de inmunología, incluyendo el etiquetado y clasificación de células inmunitarias. También abarca métodos de proliferación de células inmunitarias y anticuerpos, así como inmunoensayos comunes incluyendo el ELISA. Por último, muestra la tinción y la obtención de imágenes de muestras de células y tejidos inmunitarios.

See how confocal fluorescence microscopy uses lasers, a pinhole, and z-stacks to reveal protein location in mouse fibroblasts and other cells.

Confocal Microscopy for Protein Localization

Description

Transcript

Tags