Name: chromium release assay for immune cell killing
Uploaded: 2023-04-30T07:09:15.000Z
Duration: 11 min 48 s
Channel: JoVE

Descripción general del procedimiento
El típico ensayo de liberación de 51Cr para medir la muerte celular implica los siguientes pasos:
<ol><li>En primer lugar, las celdas de destino se etiquetan con Na2[51Cr]O4. Esto los distingue de las células efectoras en el ensayo.</li>
	<li>Mientras que las células diana están etiquetando, las células efectoras se recogen y, utilizando la técnica de dilución en serie, se genera una valoración decreciente de las células del efector en una placa de ensayo de 96 pocillos de fondo redondo.</li>
	<li>Al final del etiquetado de la célula objetivo, las células se lavan primero y luego se agrega un número fijo de células a la placa de ensayo que ya contiene una serie de diluciones de células efectora.</li>
	<li>A continuación, la mezcla de células de efector de destino se incuba durante un período de tiempo definido para permitir una interacción celular suficiente con las celdas de destino, para mediar la lisis celular.</li>
	<li>Finalmente, los supernatantes de cultivo se cosechan y se recogen en tubos. La cantidad de 51Cr se cuantifica utilizando un contador gamma.</li>
	<li>Al final, los datos se recopilan y se utilizan para calcular la "lisis de celda específica porcentual" de las celdas de destino.</li>
</ol>1. Etiquetado de celdas objetivo con 51Cr
<ol><li>Para empezar, preparar las células diana, (aquí, la línea celular de melanoma humano WM793), en una suspensión de una sola célula.</li>
	<li>Para ello, primero retire los medios del matraz de cultivo de tejido.</li>
	<li>Luego, lave las células con 5 ml de 1X PBS.</li>
	<li>Pruebe las células agregando 1 ml de trippsina a la placa durante 2 min.</li>
	<li>Toque suavemente el matraz para aflojar las células de la superficie del matraz.</li>
	<li>Agregue 5 ml de medios RPMI al matraz y pipetee los medios hacia arriba y hacia abajo para separar las células.</li>
	<li>Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar la suspensión celular durante 5 minutos a 1200 rpm. Decantar al sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 10 ml de medios al pellet y canalizar suavemente los medios hacia arriba y hacia abajo para poner las células en suspensión.</li>
	<li>Determinar la concentración celular utilizando un hemocitómetro.</li>
	<li>Transfiera 1x106 células a un nuevo tubo cónico de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 1200 rpm y decantar el sobrenadante.</li>
	<li>Brevemente vórtice el tubo para resuspender el pellet celular en el pequeño volumen de medio dejado atrás.</li>
	<li>Añadir 100 ci de 51Cr directamente a la suspensión de celda objetivo WM793. Nota: Debe haber un espacio de laboratorio dedicado configurado para la radiactividad particular. Además, debe haber un amplio blindaje de plomo para el almacenamiento seguro y el uso de la 51Cr durante todos los pasos, así como la señalización adecuada para indicar dónde se guardan las muestras con 51Cr. También es necesario un contador Geiger equipado con una sonda de panqueques, para examinar el espacio para detectar una posible contaminación.
</li>
	<li>Agregue un pequeño trozo de cinta radiactiva al tubo para indicar que el tubo es ahora radioactivo.</li>
	<li>Coloque el tubo en una incubadora de 37oC con un protector de plomo e incubar durante 1 h. Deslice el tubo cada 15-20 minutos para aumentar la acumulación de la célula objetivo del cromo.</li>
	<li>Después del período de incubación, lave las células diana con 5 ml de FBS para eliminar cualquier exceso de 51Cr.</li>
	<li>Centrifugar las células a 1200 rpm durante 5 min. Decant radioactive FBS lavar en el contenedor de residuos adecuado.</li>
	<li>Resuspende el pellet y lávelo por segunda vez con FBS. Compruebe la radiactividad incorporada en el pellet utilizando un contador Geiger.</li>
	<li>Resuspender el pellet en medio completo de 10 ml, logrando una concentración celular de 105 células/ml. Nota: El paso de recuento de células después del etiquetado 51Cr se omite aquí en gran medida por las razones de seguridad. Se puede suponer que la concentración celular WM793 es la misma que antes del etiquetado 51Cr.
</li>
</ol>2. Preparación de células efector
<ol><li>Se puede utilizar una variedad de células efector, como células T humanas o de ratón y células NK. En este ejemplo, se utilizaron PMAC, aislados de sangre entera por centrifugación de gradiente de densidad estándar (a una concentración de 5x106).</li>
	<li>Para empezar, agregue 100 s de medio de cultivo de tejido a cada pocal de una de las filas (aquí fila A, Ver Tabla 1) de una placa de fondo redonda de 96 pocillos. Aquí, no se agregan celdas efector, y servirán como el 'en blanco' para determinar la "liberación mínima/espontánea 51Cr" de las celdas de destino.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505table1.jpg"> Tabla 1: Diseño del ensayo de liberación de 51Cr: Celdas de la fila A- Objetivo (104 celdas/ 100 l) incubadas con medios solamente (genera 'en blanco' para determinar la "liberación mínima/espontánea 51Cr"). Filas B a C- pozos que contienen diferentes efectores: relaciones de celda objetivo (E:T), que van desde 50:1 a 1.5:1. Fila H- células de destino (104 celdas/100 l) incubadas con 1% NP-40 (NP-40 lisa las celdas de destino, generando "liberación máxima o total de 51Cr"). Cada relación E:T se prueba en triplicado para cada condición experimental. Columna 1-3- PMUCs no estimulados y columna 4-6- PPC estimulados por CpG.
<ol start="3"><li>A continuación, generar una dilución de células seriales 2X de los PBIC (en triplicado para cada condición experimental), para obtener una concentración de células efectoras que van desde 5x105 a 15,625 células/100 l de medios (aquí filas B a G). Nota: En este ejemplo, el efector inicial: la relación de celda de destino (E: T) es 50:1. Sin embargo, esta relación se puede ajustar dependiendo de los detalles experimentales.
</li>
	<li>Deje la última fila vacía (aquí fila H) sin agregar ninguna celda de efector a estos pozos. (Esta fila se utilizará para generar los "recuentos totales/min, o (c. p. m)" o la "liberación máxima de 51Cr").</li>
	<li>Coloque la placa en una incubadora de 37oC hasta que las celdas de destino estén listas para ser añadidas.</li>
</ol>3. Adición de 51Cr etiquetadoWM793 células de destino al ensayo
<ol><li>Después del período de incubación, retire las células diana de la incubadora y lave con 5 ml de FBS para eliminar cualquier exceso de 51Cr.</li>
	<li>Centrifugar las células a 1200 rpm durante 5 min, utilizando una centrífuga designada.</li>
	<li>Retire el lavado FBS (sobrenadante radiactivo) en un contenedor de residuos apropiado.</li>
	<li>Repita el paso de lavado resuponiendo el pellet en un fresco 5 ml de FBS.</li>
	<li>Centrifugar las células de nuevo a 1200 rpm durante 5 min.</li>
	<li>Finalmente, resuspende el pellet en 10 mL de medio completo.</li>
	<li>Vierta la suspensión celular WM793 con etiqueta cr 51(105 celdas/ml) en un depósito de reactivos desechable.</li>
	<li>A continuación, agregue 100 l de estas celdas de destino etiquetadas a cada pozo de la placa celular efectora de 96 pocillos, utilizando una pipeta multicanal.</li>
	<li>A continuación, agregue 100 l de 1% NP-40 (en agua) a la fila de pozos que están desprovistos de cualquier célula efector (aquí fila H). 1% NP-40 atisfará las celdas de destino, y por lo tanto estos pozos servirán como controles para determinar los "recuentos totales/min, o (c. p. m)" o la liberación máxima de 51Cr.</li>
	<li>Asegure la tapa a la placa añadiendo una pequeña pieza de cinta permeable al gas a cada lado de la placa y coloque un trozo de cinta radiactiva en la tapa para indicar que contiene 51Cr.</li>
	<li>Brevemente, centrifugar la placa a 1200 rpm. Si sólo se utiliza una placa experimental, agregue una placa de equilibrio a la centrífuga. Nota: Es importante utilizar una centrífuga marcada para manejar muestras radiactivas.
</li>
	<li>Retire la placa de la centrífuga.</li>
	<li>Coloque la placa en una incubadora de 37oC con un pequeño trozo de blindaje de plomo sobre la placa para mayor seguridad. Incubar durante 16 h para permitir la lisis celular diana. Nota: El período de incubación puede variar de 4 a 18 h dependiendo de las células efectoras utilizadas y el mecanismo potencial de matanza empleada.
</li>
</ol>4. Cosecha de los Supernatants
<ol><li>Al final del período de incubación, retire cuidadosamente la cinta alrededor del borde de la placa y retire la tapa.</li>
	<li>A continuación, coloque el marco de cosecha en la placa, asegurándose de confirmar que los pequeños discos de filtro están en su lugar para cada uno de los tapones de algodón. Esto asegurará la colección de un sobrenadante libre de células.</li>
	<li>Ahora, presione lentamente y suavemente los tapones de algodón en los pozos.</li>
	<li>Después de aproximadamente 10 segundos, suelte la presión sobre los tapones de algodón y luego transfiera los tapones de algodón a las tiras de tubo.</li>
	<li>Coloque cada uno de estos tubos en un tubo FACS secundario.</li>
	<li>Finalmente, cargue los tubos FACS en el contador gamma y ejecute las muestras para cuantificar la cantidad de 51Cr liberadas en cada condición. Las muestras se miden típicamente durante 1 minuto, lo que permite una fácil determinación de los "cuentas/minuto".</li>
	<li>Con cuidado, registre el orden en que se cargaron los tubos en el mostrador.</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>Aquí, los PbMU no estimulados se añadieron a las tres primeras columnas, y los PBMC estimulados por CpG (CpG ODN, (1 g/ml) para 24 h) se agregaron a las columnas 4-6. Véase el Cuadro 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Un</td>
			<td>1251</td>
			<td>1157</td>
			<td>1086</td>
			<td>917</td>
			<td>1118</td>
			<td>1140</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>1832</td>
			<td>1986</td>
			<td>1971</td>
			<td>7629</td>
			<td>7913</td>
			<td>8180</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>1677</td>
			<td>1739</td>
			<td>1428</td>
			<td>5454</td>
			<td>5055</td>
			<td>5268</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>1638</td>
			<td>1552</td>
			<td>1734</td>
			<td>4239</td>
			<td>3582</td>
			<td>3786</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>1658</td>
			<td>1580</td>
			<td>1339</td>
			<td>2818</td>
			<td>2623</td>
			<td>2750</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>1579</td>
			<td>1472</td>
			<td>1483</td>
			<td>2028</td>
			<td>1779</td>
			<td>1769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>1326</td>
			<td>1325</td>
			<td>1184</td>
			<td>1801</td>
			<td>1654</td>
			<td>1565</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>9220</td>
			<td>9367</td>
			<td>8067</td>
			<td>8774</td>
			<td>9647</td>
			<td>8236</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Ⅰ</td>
			<td colspan="2">Promedio de A1, A2,A3 -&gt;</td>
			<td>1164.67</td>
			<td>C.p.m espontáneo</td>
			<td></td>
			<td>1058.33</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>J</td>
			<td colspan="2">Promedio de B1, B2,B3 -&gt;</td>
			<td>1929.67</td>
			<td>9.91%</td>
			<td></td>
			<td>7907.33</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>50:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>K</td>
			<td colspan="2">Promedio de C1,C2,C3 -&gt;</td>
			<td>1614.67</td>
			<td>5.83%</td>
			<td></td>
			<td>5259</td>
			<td>53.67%</td>
			<td>25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>L</td>
			<td colspan="2">Promedio de D1,D2,D3 -&gt;</td>
			<td>1641.33</td>
			<td>6.17%</td>
			<td></td>
			<td>3869</td>
			<td>35.91%</td>
			<td>12.5:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>M</td>
			<td colspan="2">Promedio de E1,E2,E3 -&gt;</td>
			<td>1525.67</td>
			<td>4.68%</td>
			<td></td>
			<td>2730.33</td>
			<td>21.36%</td>
			<td>6.25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>N</td>
			<td colspan="2">Promedio de F1, F2,F3 -&gt;</td>
			<td>1511.33</td>
			<td>4.49%</td>
			<td></td>
			<td>1858.67</td>
			<td>10.22%</td>
			<td>3.12:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>O</td>
			<td colspan="2">Promedio de G1, G2, G3 -&gt;</td>
			<td>1278.33</td>
			<td>1.47%</td>
			<td></td>
			<td>1673.33</td>
			<td>7.86%</td>
			<td>1.56:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>P</td>
			<td colspan="2">Promedio de H1,H2,H3 -&gt;</td>
			<td>8884.67</td>
			<td>Máximo c.p.m</td>
			<td></td>
			<td>8885.67</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Unstim PBMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CpG-stim PBMC</td>
			<td>Relación E:T</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: 51Cr datos del ensayo de la versión: Valores de datos 'Counts per minute' / 'c. p. m', valores de c. p. m promedio y valores de lisis específicos de porcentaje calculado.
<ol start="2"><li>Los datos recogidos (cuentas por minuto, es decir, c.p.m) se introdujeron en las celdas de una hoja de cálculo de la misma manera que las muestras se colocaron en la placa original.</li>
	<li>En primer lugar, se calcularon los promedios de los triplicados. Tabla 2 - células I3 a P3, para PMUCs no estimulados y células I6 a P6, para PMCs estimulados por CpG.</li>
	<li>Una vez determinados los promedios, el porcentaje de lisis específica para cada condición se calculó utilizando la siguiente formula- <img src="/files/ftp_upload/10505/10505eq1.jpg">
</li>
	<li>El porcentaje de lisis específica se calculó para cada condición (Tabla 2 - células J4 a O4, para PPM no estimulados y J7 a O7, para PBL no estimulados).</li>
</ol>

El ensayo descrito aquí tiene una flexibilidad considerable, ya que se puede utilizar una variedad de células efector y diana dependiendo de la pregunta que se haga. Por ejemplo, la especificidad de las células efectoras se puede determinar mediante el uso de diferentes células diana o el mecanismo de muerte de células efectoras se puede determinar mediante el uso de células deficientes en proteínas específicas o el uso de inhibidores específicos de proteínas. Un problema importante con el ensayo de liberación de 51...

ensayo sobre la muerte celular: ensayo de liberación de cromo de la capacidad citotóxica

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

Fuente: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3y Thomas S. Griffith1,2,3,4 1 Programa de Posgrado en Microbiología, Inmunología y Biología del Cáncer, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455 2 Centro de Inmunología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455 3 Departamento de Urología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455 4 Centro De Cáncer Masónico, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Una de las principales funciones de las células del sistema inmunitario es eliminar las células diana que han sido infectadas con virus o han sufrido transformación en una célula tumoral. Los ensayos in vitro para medir la capacidad citotóxica de las células inmunitarias han sido un elemento básico en los laboratorios durante muchos años. Estos ensayos se han utilizado para determinar la capacidad de las células T, células NK, o cualquier otra célula inmune para matar las células diana de una manera específica de antígeno o -no específico. Los ligandos de la muerte (por ejemplo, Fas ligando o TRAIL), las citoquinas (por ejemplo, IFNg o TNF) o gránulos citotóxicos (es decir, perforin/granzyme B) expresados por las células efectoras son algunas formas en que se puede inducir la muerte celular diana. Con la explosión en la investigación de inmunoterapia tumoral en los últimos años, hay un creciente interés en encontrar agentes para aumentar la actividad citotóxica de las células inmunitarias para mejorar los resultados del paciente. Por el contrario, algunas enfermedades se caracterizan por la actividad excesivamente exuberante de la actividad citotóxica de las células inmunitarias, lo que resulta en esfuerzos para identificar agentes para templar estas respuestas. Por lo tanto, tener un ensayo en el que el usuario puede integrar fácilmente cualquier número de diferentes células efectoras, células diana y / o modificadores de respuesta en el diseño experimental puede servir como un medio valioso de evaluar rápidamente la capacidad citotóxica de las células efectoras y / o la capacidad de respuesta de la célula objetivo.
Estos ensayos in vitro implican la mezcla de diferentes poblaciones celulares, así como el uso de un número relativamente bajo de células efectoras y dianas. Por lo tanto, una necesidad del ensayo es etiquetar las celdas de destino de una manera que pueda ser fácilmente detectada y cuantificada, permitiendo al usuario determinar el 'porcentaje específico de lisis' mediado por las células del efector. La radiactividad - especialmente, cromo 51(51Cr) en forma de Na251CrO4- es una manera económica de etiquetar rápida e inespecíficamente las proteínas celulares dentro de las células diana (1). El etiquetado corto y los tiempos totales de ensayo reducen el potencial de cambios significativos en el número y/o fenotipo de las células diana, lo que podría influir en el resultado del ensayo. Tras la pérdida de la integridad de la membrana de las células diana como resultado de la actividad citotóxica de las células efectoras, las 51proteínas celulares etiquetadas con Cr dentro de las células diana se liberan en el sobrenadante del cultivo, Cuantificación. Al igual que con cualquier ensayo que examine la función de las células inmunitarias in vitro,hay una serie de consideraciones importantes a considerar la mejora del rendimiento del experimento. Una de las características más críticas es utilizar células efectora saludable (para la máxima actividad citotóxica) y células diana (para máxima capacidad de respuesta y mínima muerte espontánea / liberación de51Cr). Se requiere contacto de células objetivo y efector (lo que lleva al uso común de placas de 96 pocillos de fondo redondo para fomentar el contacto con células celulares) (2). Por último, el análisis de datos depende de la inclusión de poblaciones de células objetivo de control positivo y negativo.
El siguiente protocolo describirá los pasos para realizar un ensayo de liberación estándar de 51Cr para medir la capacidad citotóxica de una población de células efectoras, aunque recientemente se ha desarrollado una versión no radioactiva con Europium. 51 Cr es un emisor de radiación de gran alcance. En consecuencia, el uso de este ensayo requiere un entrenamiento adecuado de seguridad de la radiación, un espacio de laboratorio dedicado, un contador gamma y la eliminación de muestras radiactivas.
La secuencia general de eventos en este ensayo es: 1) preparar 51objetivos con etiqueta Cr; 2) preparar las células efectoray y añadir a la placa mientras las células objetivo están etiquetando; 3) añadir objetivos etiquetados a la placa; 4) placa de incubación; 5) cosechar supernatantes; y 6) analizar los datos después de ejecutar muestras en el mostrador. Las muestras se preparan comúnmente en triplicado, y luego se promedian para tener en cuenta cualquier diferencia sutil de pipeteo.
El EPP adecuado es importante para este ensayo. Específicamente, el usuario debe usar una capa de laboratorio y guantes. Es posible que se requieran gafas de seguridad en función del laboratorio o la institución. Debe haber un amplio blindaje de plomo para el almacenamiento seguro y el uso de la 51Cr durante todos los pasos. Por último, debe haber espacio de laboratorio dedicado y equipo reservado para el uso de 51Cr, incluyendo toda la señalización adecuada para indicar dónde se guardan muestras con 51Cr y un contador Geiger equipado con sonda gamma para inspeccionar el espacio para Contaminación.
En este ejercicio de laboratorio, determinaremos la capacidad de las células mononucleares de sangre periférica humana (PPBCM), (CpG estimulado frente a no estimulado) para matar las células del melanoma, utilizando la línea celular de melanoma humano WM793 como modelo y el ensayo de liberación de cromo.

En este ejemplo, las células efectoras estimuladas con CpG (Figura 1, círculos negros)mataron las células diana de manera más efectiva, a medida que aumentaba la proporción de células efectoras con las células objetivo. Este aumento no se observó en los PASTRO no estimulados(círculos blancos),lo que indica que la estimulación del CpG es necesaria para el aumento observado de la lisis de las células diana.
<img ...

Ensayo sobre la muerte celular: Ensayo de liberación de cromo de la capacidad citotóxica

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

En este vídeo observarás cómo realizar el ensayo de liberación de cromo y determinar el potencial citotóxico de las células efectoras. Las células inmunitarias son responsables de identificar y eliminar del cuerpo las células potencialmente dañinas, como las células cancerosas o infectadas por virus, que es una parte integral de la respuesta inmunitaria. Varias células inmunitarias, como las células T y las células NK, poseen una propiedad conocida como potencial citotóxico, que es la capacidad de identificar las células objetivo y secretar proteínas que inducen la degradación de proteínas, la lisis y la muerte de esas células objetivo. La cuantificación del potencial citotóxico es fundamental para medir la activación y la potencia de las células inmunitarias, y el ensayo de liberación de cromo se utiliza habitualmente para este fin. Este método permite a los usuarios comparar la citoxicidad inducida por tipos específicos de células inmunitarias en diferentes condiciones, lo que es valioso para estudiar la inmunoterapia contra el cáncer y las enfermedades relacionadas con la inmunidad. Para empezar, las células objetivo, al igual que las células cancerosas, se incuban con un isótopo radiactivo, el cromo 51, que es absorbido por las células. A continuación, estas células radiomarcadas se cultivan conjuntamente con las células inmunitarias aisladas de interés, también llamadas células efectoras, en una placa de 96 pocillos de fondo redondo para facilitar la interacción entre los dos tipos de células. La configuración general del ensayo implica la incubación de un número específico de células diana con diferentes concentraciones de células inmunitarias, junto con los controles adecuados. El cocultivo permite a las células efectoras inducir la apoptosis y la lisis en las células diana, lo que resulta en la liberación del cromo intracelular 51 en el sobrenadante. Luego, en un punto de tiempo preoptimizado, el sobrenadante que contiene el cromo liberado se cosecha de todos los pozos. El cromo 51, al ser radiactivo, sufre espontáneamente una desintegración radiactiva para emitir radiación gamma. Los niveles de radiación gamma en los sobrenadantes de todos los pocillos de la placa de ensayo representan una salida cuantificable de la lisis de las células objetivo. Esto se mide utilizando un contador gamma, que luego se utiliza para determinar el potencial citotóxico de las células inmunitarias. Para empezar, las células objetivo, la línea celular de melanoma humano WM793 en este ejemplo, se preparan en una suspensión de una sola célula. Para ello, primero retire el medio del matraz de cultivo de tejidos y lave las células con cinco mililitros de PBS 1X. Decantar el PBS y luego agregar un mililitro de tripsina al plato durante aproximadamente dos minutos. Golpee suavemente el matraz para aflojar las células de la superficie del matraz y luego agregue cinco mililitros de medios RPMI al matraz. Pipetea el medio hacia arriba y hacia abajo para recoger las células y añadir esta suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros. Coloque el tubo en la centrífuga durante cinco minutos a 1200 RPM. A continuación, retire el medio del tubo asegurándose de no interrumpir el pellet de la celda. Golpee suavemente la parte inferior del tubo para romper el pellet de la celda y agregue 10 mililitros de medio al tubo. A continuación, pipetea suavemente los medios hacia arriba y hacia abajo para poner las células en suspensión. A continuación, determine la concentración celular con un hemocitómetro y transfiera dos mililitros de la suspensión celular original a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Coloque el tubo en una centrífuga y granule las celdas a 12 mil RPM durante cinco minutos. Después de la centrifugación, vierta el exceso de medio fuera del tubo en un contenedor de desechos. Agite brevemente el tubo para resuspender la célula en el pequeño volumen de medio que queda. A continuación, prepárese para usar Chromium 51 trasladándose a un espacio de laboratorio dedicado a esta radiactividad en particular. Debe haber un amplio blindaje de plomo para el almacenamiento y uso seguro del Chromium 51 durante todos los pasos, así como una señalización adecuada para indicar dónde se guardan las muestras con Chromium 51. También es necesario un contador Geiger equipado con una sonda de panqueques para servir en el espacio por posible contaminación. Una vez configurado para el uso adecuado de la radiactividad, agregue 100 microcurios de Cromo 51 directamente a la suspensión de la célula objetivo. Luego, agregue un pequeño trozo de cinta radiactiva al tubo para indicar que la muestra y el tubo ahora son radiactivos. Coloque el tubo en una incubadora a 37 grados centígrados con un protector de plomo e incube durante una hora, agitando el tubo cada 15 a 20 minutos. Mientras se etiquetan las células objetivo, prepare una suspensión de células efectoras de una sola célula. En este ejemplo, las células mononucleares de sangre periférica humana, o PDMC, se aislaron de la sangre total mediante centrifugación en gradiente de densidad estándar a una concentración de 5 veces 10 a la 6ª. Transfiera esta suspensión de celda efectora a un depósito de reactivo desechable y luego agregue 200 microlitros de esta suspensión en cada pocillo de la fila B en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. A continuación, agregue 100 microlitros de RPMI a cada pocillo en la fila C a G del plato. Ahora, comience a realizar diluciones en serie de las PBMC para tener un rango de números de células efectoras eliminando primero 100 microlitros de las células en los pocillos de la fila B y agregándolas a la fila C. A continuación, diluya aún más las células efectoras transfiriendo 100 microlitros de células de la fila C a la fila D. Continúe con la dilución en serie. Una vez que se alcanza la fila G, mueva 100 microlitros de los pocillos para dejar un volumen final de 100 microlitros en cada pocillo de esa fila. A continuación, se añadan 100 microlitros de medio de cultivo de tejidos a los pocillos de la fila A para que sirvan de control de la liberación espontánea de cromo 51 de las células objetivo, ya que no se deben añadir células efectoras a esta hilera. Luego, coloque una placa en una incubadora a 37 grados centígrados hasta que las células objetivo estén listas para agregarse. Después del período de incubación, retire las células objetivo de la incubadora y lávelas con 5 mililitros de FBS para eliminar el exceso de cromo 51. Luego, coloque el tubo en una centrífuga designada y gire a 1200 rpm durante 5 minutos. Retire el lavado radiactivo de FBS en un contenedor de residuos adecuado y repita el paso de lavado volviendo a suspender el pellet en 5 mililitros nuevos de FBS. Coloque el tubo en una centrífuga designada y vuelva a hacer girar las celdas a 1200 rpm durante 5 minutos. Retire el segundo lavado y compruebe si el pellet tiene radiactividad incorporada con un contador Geiger. Finalmente, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio completo y vierta la suspensión de células objetivo etiquetada con Chromium 51 en un depósito de reactivo desechable. Luego, agregue 100 microlitros de estas células objetivo marcadas a cada pocillo de la placa de celdas efectoras de 96 pocillos. A continuación, añada 100 microlitros de NP-40 al 1% en agua a los pocillos de la fila H para lisar todas las células objetivo de cada hilera. Estos pozos se utilizarán como control para determinar los recuentos totales por minuto, o cpm. Ahora que el plato está preparado, asegure la tapa agregando un pequeño trozo de cinta adhesiva a cada lado del plato y coloque un trozo de cinta radiactiva en la tapa para indicar que contiene cromo 51. Luego, coloque la placa en una centrífuga marcada para manejar muestras radiactivas. Si solo se utiliza una placa experimental, agregue una placa de equilibrio a la centrífuga. Ajuste la centrífuga a 1200 rpm y ponga la placa a la velocidad. Una vez a la velocidad, detenga la máquina. Retire la placa de la centrífuga. Luego, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados con una pequeña pieza de protección de plomo sobre la placa para mayor seguridad. Incubar durante 16 horas para permitir que las células objetivo se lisen. Al final del período de incubación, retire con cuidado la cinta alrededor del borde de la placa y retire la tapa. A continuación, coloque el marco de recolección en la placa asegurándose de confirmar que los pequeños discos de filtro estén en su lugar para cada uno de los tapones de algodón. Ahora, presione lenta y suavemente los tapones de algodón en los pozos. Después de aproximadamente diez segundos, libere la presión sobre los tapones de algodón y luego transfiera los tapones de algodón a tiras de tubo. Coloque cada uno de estos tubos en un tubo FACS secundario. Finalmente, cargue los tubos FACS en un contador gamma y ejecute las muestras para cuantificar la cantidad de cromo 51 liberado en cada condición. Registre cuidadosamente el orden en que se cargaron los tubos en el mostrador. Aquí, se agregaron PBMC no estimulados a los primeros 3 carriles y PMBC estimulados por CPG a los carriles 4 a 6. En este ejemplo, los recuentos por minuto se introdujeron en las celdas de una hoja de cálculo de la misma manera que las muestras se colocaron en la placa original y se calcularon los promedios de los triplicados. Por ejemplo, para la primera condición, las celdas A1, A2 y A3 se promediaron en la celda I3. Una vez que se determinan los promedios, se puede calcular el porcentaje de lisis específica para cada condición utilizando esta fórmula. Por ejemplo, para calcular el porcentaje de lisis específica para las células no estimuladas que tenían una proporción de 50 a 1 células efectoras con respecto a las células diana, el CPM espontáneo, que en este ejemplo es 1164,67, se restó del CPM experimental, 1129. 67. Este número se puede dividir por la diferencia entre el CPM máximo y el CPM espontáneo, y luego multiplicar por 100 para obtener el porcentaje de lisis específica. A continuación, se calcula para cada condición. Estos datos se pueden graficar para mostrar la comparación de la relación E a T con el porcentaje de lisis específica tanto para las PBMC no estimuladas como para las PBMC estimuladas por CPG. En este ejemplo, las células efectoras estimuladas con CPG mataron de forma más eficaz a las células diana a medida que aumentaba la proporción de células efectoras con respecto a las células diana. Este aumento no se observó en las PBMC no estimuladas, lo que indica que la estimulación de CPG es necesaria para el aumento observado en la lisis de las células diana.

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Advanced Biology

Biología Avanzada

Immunology

Inmunología

chromium release assay for immune cell killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells.

This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant and can be measured.

Researchers use this setup to study antigen-specific and nonspecific killing. It is also useful in tumor immunotherapy research, where scientists may look for agents that boost immune cell killing. In other cases, the assay can help test ways to reduce overly strong immune cytotoxic activity.

Several practical points matter for a good result. Healthy effector cells give stronger killing, and healthy target cells help keep spontaneous death and background chromium release low. Because cell-to-cell contact is needed, round-bottom 96-well plates are often used. Proper data analysis also requires positive and negative control target cell groups.

The standard protocol includes preparing 51Cr-labeled targets, preparing effector cells, adding both cell groups to the plate, incubating, harvesting supernatants, and then analyzing the samples on a counter. Samples are often run in triplicate and averaged to reduce the effect of small pipetting differences. A nonradioactive Europium-based version is also available.

Because 51Cr is a powerful gamma radiation emitter, the assay requires radiation safety training, dedicated lab space, a gamma counter, and proper waste disposal. Users should wear a lab coat and gloves, and safety glasses may also be required. Lead shielding, clear signage, and a Geiger counter with a gamma probe are important for safe handling and contamination checks. In this lab exercise, human peripheral blood mononuclear cells, or PBMCs, are tested as CpG-stimulated or unstimulated effector cells against WM793 human melanoma cells.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

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flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

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Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

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Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

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ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

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ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

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Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

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Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

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Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

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Confocal Microscopy for Protein Localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

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Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

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Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

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Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

Esta colección incluye diversas técnicas básicas de inmunología, incluyendo el etiquetado y clasificación de células inmunitarias. También abarca métodos de proliferación de células inmunitarias y anticuerpos, así como inmunoensayos comunes incluyendo el ELISA. Por último, muestra la tinción y la obtención de imágenes de muestras de células y tejidos inmunitarios.

Measure immune cell killing with the chromium release assay. Learn how 51Cr-labeled target cells, PBMCs, and melanoma cells are used to assess cytotoxicity.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

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