Fabricación de electrodos amperométricos

Resumen

Este protocolo se describe cómo generar electrodos de fibra de carbono. Los electrodos se utilizan posteriormente para detectar la liberación de catecolaminas de las vesículas con amperometría de fibra de carbono.

Resumen

Electrodos de fibra de carbono son cruciales para la detección de la liberación de catecolaminas de las vesículas en las células individuales para las mediciones de amperometría. A continuación, describimos las técnicas necesarias para generar ruido bajos (<0,5 pA) electrodos. Las técnicas han sido modificadas a partir de las descripciones publicadas por otros investigadores (1,2). Los electrodos son hechos por la preparación de fibras de carbono y los hilos de forma individual en cada tubo capilar mediante el uso de una aspiradora con un filtro para aspirar la fibra. A continuación, el tubo capilar con la fibra es tirado por un extractor de electrodos, la creación de dos mitades, cada una con una punta afilada. Los electrodos se sumergen en epoxi líquida caliente mezclada con el endurecedor para crear un sello de epoxy de cristal. Por último, los electrodos se colocan en un horno para curar la resina. El manejo cuidadoso de los electrodos es fundamental para garantizar que se hace de forma coherente y sin daños. Este protocolo se muestra cómo fabricar y cortar electrodos amperométricos para la grabación de una sola célula.

Protocolo

Parte 1: Preparación de fibra de carbono

1. Cortar un haz de fibras de carbono (que utilizamos 7μm diámetro) en una longitud que es de ~ 1,25 X la longitud de la pipeta capilar.
2. Retire el tamaño de punto de ebullición ~ 100 ml de acetona en un recipiente y añadir las fibras a la acetona caliente, hirviendo durante 30 minutos o más.
3. Eliminar las fibras de la acetona caliente, y transferir a un vaso limpio con 50-100 ml de acetona fresca.
4. Fibras secas, colocando el paquete en un abrir 150 mm placa de Petri y la noche airdry.

Parte 2: pulido fuego tubos capilares

1. Fuego pulir cada tubo capilar (se utiliza micro-hematócrito tubos capilares, diámetro exterior 1,5 mm, diámetro interior de 1,3 mm, 7,5 cm de largo) manteniendo el tubo en el centro con unas pinzas y exponer al final de la flame.Rotate el tubo alrededor de 3 veces, mientras que en la llama.
2. Invierta el tubo y coloque el extremo opuesto a la llama, de nuevo girando tres veces.
3. Coloque los tubos pulida al fuego en un recipiente de vidrio y llevar al horno hasta que estén listos para ser llenados con fibras de carbono.

Parte 3: enhebrar una fibra de carbono en un tubo capilar

1. Similar a las descripciones de Machado et al. (2008) y Mundroff y Wightman (2002), aspirar la fibra en el tubo de vidrio con un tubo de plástico conectado a una aspiradora con un filtro.
2. Cortar la fibra con un scalpel.Leave de ¼ de pulgada de las fibras del tubo.

Parte 4: Tirar de una pipeta de fibra en un extractor de electrodos

1. Colocar el tubo capilar en el extractor de electrodos (usamos Narishige Japón Modelo PP-830) y apriete los tornillos para sostener el tubo capilar en el lugar.
2. Manipular los interruptores de la ejecución de dos intentos, fijado en la configuración del extractor óptimo.
3. Una vez que la pipeta se tira por la mitad, separar las dos mitades por el corte de la fibra desnuda en el centro con unas tijeras.
4. Retire cada medio de electrodos y tire de la fibra que sobresalen de romper el vidrio de la fibra seal.Trim con unas tijeras para que sólo el 1 / 8 de pulgada de fibra que queda fuera del tubo.
5. Repita los pasos 1-4 hasta que alrededor de 16 fibras-electrodos se retiró.

Parte 5: Hacer epoxi-vidrio Sello

1. Calentar una parte alícuota de pre-hechas de epoxi en un plato caliente ajustado a 55 ° C durante 6 minutos en una campana extractora.
2. Mientras epoxi se está calentando, envuelva a 16 de los electrodos se detuvo en un paquete mediante el uso de la cinta.
3. Después de la resina Epon se calienta durante 6 minutos, añadir 0,7 gramos XOF MPDA a los baños de resina Epon (14% w / v). Mezclar por agitación del vial.
4. Sumerja el paquete de electrodos en la resina caliente más solution.After endurecedor unos 20 segundos, una cantidad suficiente de epoxi entrará en las puntas de vidrio a través de la acción capilar.
5. Deshacer el paquete, los electrodos en lugar de cartón con ranuras y el lugar esta bandeja en un horno a 100 ° F.
6. Después de al menos 48 horas, examinar cada electrodo en una electrodos microscope.Discard disección que no se llenan con resina epoxi, tienen una punta se estrelló, tiene más de una fibra, etc.After inspección de cada electrodo, coloque de nuevo en el soporte de cartón y de regreso en el oven.Electrodes suelen ser buenos para alrededor de 1 mes después de su fabricación.

Parte 6: Corte de la fibra de carbono

1. De fibra de carbono lugar electrodo con cuidado sobre un portaobjetos de vidrio con cinta de teflón.
2. Visualizar la punta con un microscopio de disección.
3. Use una hoja de bisturí limpios para cortar de forma perpendicular por la fibra de carbono para dejar una superficie plana y limpia para la colocación de la fibra de carbono en contra de una célula.

Discusión

Este protocolo se describe cómo generar y cortar electrodos amperométricos. En las grabaciones amperométrica, un electrodo de fibra de carbono se coloca contra la superficie de una célula secretora. La actividad de exocitosis se observa como los picos de amperométrica, lo que indica la corriente electroquímica causada por la transferencia de electrones después de la oxidación de las catecolaminas. Con la práctica de decisiones y reducir los electrodos amperométricos, los niveles de ruido puede ser mejorado en muchos de ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Escamas de 1,3-fenilendiamina endurecedora de epoxi	Reactivo	Sigma-Aldrich	P23954-100G04 716AJ	Los alícuotas se almacenan en un desecador y no deben exponerse a la luz.
Fibras de carbono	Material	Goodfellow	C005725
Tubos capilares microhematocrito	Material	Fisher Scientific	NC9836768
Resina epoxi	Reactivo	Miller-Stephenson	Epon Resin 828
Microscopio de disección	Instrumento
Extractor de electrodos	Instrumento	Narishige International	PP-830	1.ª tracción = 24,8 grados C; 2.ª tracción = 62,7 grados C
Horno	Instrumento			ajustado a 100 grados F.
Placa calefactora	Instrumento			ajustada a 55 grados C