Purificación y visualización de la gripe A ribonucleoprotein complejos virales

Resumen

El genoma del virus de influenza A se compone de ocho complejos separados de ARN y proteínas, denominadas complejos de ribonucleoproteína viral (vRNPs). Este trabajo describe la purificación gradiente de glicerol y de microscopía electrónica de transmisión de visualización de la gripe A vRNPs.

Resumen

La gripe A genoma viral se compone de ocho en sentido negativo, de cadena sencilla moléculas de ARN, envasadas individualmente con varias copias de la influenza A nucleoproteína (NP) en partículas virales ribonulceoprotein (vRNPs). El vRNPs influenza están encerrados dentro de la envoltura viral. Durante la entrada de la celda, sin embargo, estos complejos vRNP son liberados en el citoplasma, donde el acceso a los mecanismos de acogida de transporte nuclear. Para el estudio de la importación nuclear de vRNPs influenza y la replicación del genoma de la gripe, es útil para trabajar con vRNPs aisladas para que los otros componentes del virus no interferir con estos procesos. Aquí se describe un procedimiento para purificar estas vRNPs del virus de la influenza. El procedimiento se inicia con la ruptura de la influenza A virión con detergentes a fin de liberar los complejos vRNP del virión con envoltura. El vRNPs se separan de los otros componentes de la influenza A virión en un gradiente de glicerol 33-70% de velocidad de sedimentación discontinua. Las fracciones obtenidas del gradiente de glicerol se analizan a través de la SDS-PAGE después de la tinción con azul de Coomassie. Las fracciones que contienen NP pico después se agruparon y se concentraron por centrifugación. Después de la concentración, la integridad de la vRNPs se verifica mediante la visualización de la vRNPs por microscopía electrónica de transmisión después de la tinción negativa. La purificación del gradiente de glicerol es una modificación de que a partir de Kemler

Protocolo

Parte 1: La interrupción de la Influenza A virión

1. Añadir 750 l de tampón SM (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) en un tubo de centrífuga Beckman policarbonato (11 mm x 34 mm) diseñado para encajar en un rotor TLA-120.2 para su uso en un Beckman Optima Max-E ultracentrífuga.
2. Añadir 500 l de la gripe A (H3N2 X-31 A/AICHI/68 cepa, 2 mg / ml) en ese tubo. Mezcla del virus con el buffer de MNT pipeteando arriba y abajo varias veces.
3. Centrifugar durante 10 minutos a 109.000 xg, 4 º C, en un Beckman Optima Max-E centrífuga con un rotor TLA-120.2.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 buffer interrupció....

Discusión

La purificación de vRNPs se basa en el procedimiento descrito por Kemler et al. (1994). ¹ Nosotros y otros han utilizado también este protocolo para aislar vRNPs para estudiar su importación nuclear. ^2,4,5

Se recomienda el uso de RNasa libre de puntas y los tubos de la hora de manipular vRNPs debido a que el genoma viral se compone de ARN, y por lo tanto, se degrada fácilmente en la presencia de ARN. Además, todos los buffers deben hacerse en el agua que está l.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A	Charles River Laboratories	490715
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
MES	Sigma-Aldrich	M-8250
Glicerol	Fisher Scientific	G33-1
Octilglucósido	Sigma-Aldrich	O-8001
Lisolecitina	Sigma-Aldrich	L-4129
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	D-9779
Azul brillante de Coomassie G-250	Kodak	1367796
Agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC)	Invitrogen	750024
Acetato de uranilo	Ted Pella, Inc.	19481
Molibdato de amonio	Fisher Scientific	A-674
Ultracentrífuga Optima MAX-E	Beckman Coulter Inc.	434491
Paquete de rotor MLS-50, de cubeta oscilante	Beckman Coulter Inc.	367280
Conjunto de rotor TLA-120.2, de ángulo fijo, de titanio	Beckman Coulter Inc.	362046
Eppendorf Thermomixer	Lauda Brinkmann	022670000