ELIME (Enzyme Linked Inmuno magnética químicos) Método para la detección de micotoxinas

Resumen

Un protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interés para la salud humana), utilizando un método de selección de nuevo desarrollo basado en un método competitivo inmunoquímica y un final de la detección electroquímica se demuestra.

Resumen

Inmunoensayos son una alternativa válida a la que consumen más caro y HPLC cuantitativa o GC ^{1, 2} métodos de cribado para la detección de micotoxinas peligrosas en los productos alimenticios. En este protocolo se muestra cómo fabricar e interrogar a una enzima vinculada ensayo electroquímicos competitivos inmunomagnética basado en el uso de partículas magnéticas como soporte sólido para la cadena de inmunoquímica ³ y electrodos serigrafiados como la detección de la plataforma.

Nuestro método tiene como objetivo determinar la cantidad total de HT-2 y las toxinas T-2, las micotoxinas que pertenecen a la familia de los tricotecenos y de gran preocupación para la salud humana ^4. El uso de un anticuerpo clon con una reactividad cruzada del 100% para HT-2 y T-2 permite detectar simultáneamente dos toxinas con una sensibilidad similar ^5.

El primer paso de nuestro análisis es la etapa de recubrimiento en el que inmovilizar HT2-KLH conjugado toxina en la superficie de partículas magnéticas. Después de una etapa de bloqueo, necesario para evitar absorciones no específicas, la adición de un anticuerpo monoclonal permite la competencia entre los inmovilizados HT-2 y libres presentes HT-2 o T-2 en la muestra o en una solución estándar.

Al final de la etapa de la competencia, la cantidad de anticuerpo monoclonal ligado a la inmovilización HT-2 será inversamente proporcional a la cantidad de toxina en la solución de la muestra.

Un anticuerpo secundario marcado con fosfatasa alcalina (AP) se utiliza para mostrar la unión entre el anticuerpo específico y el inmovilizado HT-2. La etapa de medición final se realiza dejando caer una parte alícuota de la suspensión de cuentas magnéticas, correspondientes a una muestra específica / solución estándar, en la superficie de un electrodo serigrafiado de trabajo, partículas magnéticas se inmovilizan y se concentraron por medio de un imán colocado precisamente bajo el serigrafiado de los electrodos. Después de dos minutos de incubación entre partículas magnéticas y un sustrato de la AP, el producto enzimático es detectado por voltametría de pulso diferencial (DPV), utilizando un equipo portátil (PalmSens) también es capaz de iniciar automáticamente ocho mediciones en un intervalo de pocos segundos.

Protocolo

1) El bloqueo de perlas magnéticas recubiertas con:

Proceder de la siguiente manera para bloquear perlas magnéticas recubiertas con:

1. Preparar un conjunto de 2 ml tubos Eppendorf;
2. Homogeneizar (temblores, pero no agitación) de perlas magnéticas recubiertas (véase el apéndice para la preparación de perlas magnéticas recubiertas) con la muestra de rotación del mezclador;
3. Inmediatamente después de la homogeneización, pipeta de 10 l de perlas magnéticas recubiertas por separado en cada uno de los tubos Eppendorf;
4. Añadir 1 ml de leche desnatada solución de bloqueo en cada tubo Eppendorf de la serie;

Discusión

El uso de anticuerpos como la sonda de reconocimiento biomolecular ha visto un uso generalizado de tecnologías de detección, métodos inmunoquímicos de detección, tales como ELISA y Meias, son, hoy en día, entre las plataformas más utilizadas y aplicadas en muchos laboratorios de ^7.

Si bien estos enfoques lograr una sensibilidad y especificidad, el objetivo principal de muchos grupos de investigación en los últimos años ha sido la mejora y optimización de sus actuaciones.

Materiales

Reactivos

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Cloruro de potasio	Sigma	P9333
Dihidrógeno fosfato de potasio	Sigma	P9791
Fosfato disódico de hidrógeno	Sigma	S3264
Cloruro de sodio	Sigma	S3014
MgCl2 anhidro	Sigma	M8266
DEA (99,5%)	Sigma	31589
HCl 37%	Sigma	320331
H 3 BO 3	Sigma	B6768
Tris [hidroximetil]-aminometano	Sigma	252859
BSA (albúmina de suero bovino)	Sigma	A4503
NaOH	Sigma	S5881
Tween 20	Sigma	P9416
NaN 3	Aldrich	71290
1-naftil fosfato disódico sal	Fluka	N7255
Solución de leche desnatada bloquear - leche en polvo no grasa	Bio-Rad	170-6404
HT-2 conjugado con KLH (hemocianina de lapa californiana), solución de reserva (1 mg / ml en PBS):	Biopure	004050	El conjugado HT-2-KLH se obtuvo por el CDI-método en el que la libre circulación de grupos OH en la posición 3 y 4 de la toxina HT-2 fueron activados por N, N'-carbonildiimidazol (CDI) y la activa HT-2 toxina vamos a reaccionar con aminogroups de la proteína (KLH) para generar un vínculo carbammate estable.
Anticuerpo secundario marcado: Anti-ratón IgG (H + L) de caballo, conjugado con fosfatasa alcalina, la concentración de 1 mg / ml.	Vector Laboratories	AP-2000
HT-2 toxina	Biopure
Partículas magnéticas: Dynabeads ®	Dynal	M-280 Tosylactivated	Concentración de 2 x 10 9 bolas / ml.

Soluciones

Nombre del reactivo	Preparación	Comentarios (opcional)
Tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4	Disolver 0,20 g de cloruro de potasio, 0,20 g de dihidrógeno fosfato de potasio, 1,16 g de fosfato disódico de hidrógeno y 8,00 g de cloruro de sodio en 900 ml de agua
Dietanolamina de amortiguamiento, la DEA, 0,97 M + 1 mM MgCl 2 + 0,15 M KCl, pH 9,8	Disolver 0.0476g de MgCl2 anhidro y 7.3.59 g de KCl en ~ 300 ml de agua. Vez disueltos, añadir 51 ml de la DEA (99,5%). Ajustar el pH a 9.8 con HCl (6 M). Diluir hasta 500 ml con agua.
Tampón de borato, 0,1 M, pH 9,5	Disolver 3,09 g de H 3 BO 3 en ~ 300 ml de agua destilada, ajustar el pH a 9.5 con NaOH y / o HCl (6 M o menor concentración). Diluir hasta 500 ml con agua destilada.
TRIS buffer, 0,2 M, pH 8,5	Disolver 3,85 g de Tris [hidroximetil]-aminometano en 100 ml de agua. Ajustar el pH a 8.5 con NaOH y / o HCl (6 M o menor concentración). Diluir a 200 ml con agua.
Tampón TRIS + BSA solución (0,1%), pH 8,4	Disolver 0,050 g de BSA en 50 ml de TRIS buffer de pH 8,4.	Esta solución debe prepararse en el día de uso.
Tampón PBS + Tween ® 0,05%	Disolver 0,250 g de Tween 20 en 500 ml del preparado previamente buffer PBS, pH 7,4
Tampón PBS + BSA solución al 0,1%	Disolver 0,050 g de BSA en 50 ml de PBS, pH 7,3.	Esta solución debe prepararse en el día de uso.
Tampón PBS + BSA 0,1% + 0,02% NaN3	Disolver 0,050 g de BSA y 0.010 de NaN 3 en 50 ml de tampón PBS, pH 7,3.	Almacenamiento de sollución
Sustrato enzimático	Disolver 0,010 g de sal 1-naftil fosfato de sodio en 100 ml de buffer de pH 9,8 DEA. Envolver el matraz herméticamente en papel de aluminio.	Esta solución debe prepararse en el día de uso.
Solución de leche desnatada bloqueo	Añadir 0,20 g de secante bloqueador de grado de leche sin grasa seca (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) a 200 ml de tampón PBS pH 7,3.	Esta solución debe prepararse en el día de uso.
HT-2 de la solución madre	Disolver 10 mg de tricotecenos vial de toxina HT-2, en 10 ml de acetonitrilo para dar una solución con una concentración de 1 mg / ml.	Dividir esta solución en un solo uso alícuotas de 30 ml y guárdelos a menos de -30 ° C.
HT-2 la solución de trabajo estándar	Colocar 20 ml de HT-2 toxina solución de reserva en una de 2 ml calibrada matraz aforado y diluir con acetonitrilo para obtener una solución HT-2 de trabajo que contiene 10 mg / ml de toxina tricotecenos.	Esta solución debe prepararse en el día de uso.
HT-2 Trabajo soluciones calibrante	Diluir el HT-2 solución patrón de trabajo (10 mg / ml) para preparar una solución de trabajo calibrante 100 ng / ml. Diluir HT-2 Solución de trabajo de calibrante 100 ng / ml para preparar soluciones de trabajo calibrador de las siguientes concentraciones 0 (blanco), 0,5, 1, 2, 4, 10 ng / ml.	Estas soluciones deben estar recién en el día de uso.
HT-2 conjugado con KLH	Dividir HT-2 conjugado con KLH solución stock (hemocianina de lapa californiana) (1 mg / ml en PBS) en un solo uso alícuotas de 350 microlitros.	Alícuotas de almacenar a -30 ° C.
Anticuerpo monoclonal específico	Diluir 1:350 (v: v) la concentración de acciones (1,383 mg / ml) del anticuerpo monoclonal en PBS para el uso en el paso la competencia	Esta solución debe prepararse en el momento de su uso. 10 ml de solución de anticuerpos en PBS para obtener un volumen de 3,5 ml, son suficientes para analizar las 17 normas y / o muestras.
Secundaria de anticuerpos etiquetados	Anti-ratón IgG (H + L) conjugado con fosfatasa alcalina se diluye 1:100 (v: v) en PBS a utilizar en el paso de la competencia.	Una solución de 100 l de valores de anticuerpos en PBS para obtener un volumen final de 10 ml, son suficientes para analizar las normas 25 y / o muestras. Esta solución debe prepararse en el momento de su uso.

Aparato

Nombre del reactivo	Empresa	Comentarios (opcional)
Concentrador de partículas magnéticas: MPC ®-S	Dynal
PalmSens instrumento	PalmSens	Siempre con PalmSens Lite, el cable de serie de conexión PC portátil y el software de las opciones de Mux
CH8 PalmSens multiplexor	PalmSens
Ocho canales de contacto eléctrico Mux	hecho a mano
Tira con ocho electrodos serigrafiados (EFE)	hecho a mano
Apoyo especialmente diseñado para bandas de electrodos	hecho a mano	Incluye 8 imanes de neodimio de cada uno de ellos se coloca debajo de la superficie de cada electrodo de trabajo de la SPE
Calibrar pipetas microlitro	Gilson
Agitador magnético y barras de agitación.
Vasos de vidrio (100, 50, 20 ml).
Matraces aforados (2 ml).
0,2 y 2 ml tubos Eppendorf.	Eppendorf
Falcon ™ tubos de 5 ml y 15 ml.	Halcón
Laboratorio de Vortex Mixer		No utilice vórtex para resuspender perlas magnéticas recubiertas con HT2-KLH o vinculados con la cadena inmunológica para evitar la desnaturalización de las partes proteicas
Horno de laboratorio o una sala con termostato		Elegir un horno capaz de mantener una temperatura de 37 ± 3 ° C.