Se describe una técnica para la preparación de aclarar homogeneizados humanos cortical, la separación de proteínas por SDS-PAGE, la recuperación de antígeno y la inmunotransferencia con un anticuerpo para el péptido Aß. El uso de este protocolo, estamos constantemente detectar Aß monoméricos y multimérica en el tejido cortical de los seres humanos con la patología de Alzheimer.
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Artículo de método
Detección SDS-PAGE/Immunoblot de multímeros Aß en el tejido cortical humano homogeneizados utilizando antígeno de recuperación del epítopo
En este artículo
Resumen
Resumen
El plegamiento anómalo y la polimerización de la β-amiloide (Aß) péptido se cree que inician la cascada neurodegenerativa en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer
Protocolo
Parte 1: Preparación de tejido homogeneizado aclaró
- Dounce homogeneizar el tejido cortical no fijadas en 4 veces el volumen de helado de amortiguación (0,1 M de buffer fosfato salino [Ca + + - y Mg + +-libre] proteasa más 2x cóctel de inhibidores de [Santa Cruz]), con aproximadamente 30 golpes, incluso mortero (es decir, buffer añadir 400μl a 100 mg de tejido).
- Homogeneizado de giro durante 5 minutos a 3.000 g (4 ° C). Retire con cuidado el sobrenadante clarificado y almacenar alícuotas de estos extractos a -80 ° C hasta su uso.
- Determinar la concentración de proteínas totales (mg / l) para aclarar homogeneizados utilizando un ácido bic....
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Discusión
A pesar de la importancia de la agregación de Aß en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer 1,4,5, pocos estudios han descrito o cuantificar la distribución de los diversos multímeros Aß en muestras de tejido cortical 2. Comúnmente utilizado las técnicas de inmunohistoquímica no permiten la discriminación de las distintas especies de Aß multimérica en el tejido cortical fijo. En fijadas homogeneizados de tejido cortical, multímeros Aß se pueden separar y bioquímicamente evaluó mediante electro.......
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Agradecimientos
Muchas gracias a Elaine Pranski y Carolyn Suwyn por su excelente asistencia técnica y Harry Levine III, M. Paul Murphy, y Transmisiones para conversaciones importantes Marla. El financiamiento fue proporcionado por el RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, la Fundación Woodruff y la Universidad de Emory Comité de Investigación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tabletas de cóctel de inhibidores de proteasas completos | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-29130 | 1 tableta en 25 ml de tampón |
| Kit de ensayo de proteínas BCA | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| Célula Mini XCell SureLock y kit del módulo de transferencia XCell II con marca CE | Invitrogen | EI0002 | |
| Tampón de muestra Novex Tricina SDS (2X) | Invitrogen | LC1676 | |
| Agente reductor para muestras NuPAGE (10X) | Invitrogen | NP0004 | |
| Estándar preteñido SeeBlue Plus2 | Invitrogen | LC5925 | |
| Gel Novex Tricina 10-20%, 1,0 mm, 10 pocillos | Invitrogen | EC6625BOX | |
| Membranas de nitrocelulosa, tamaño de poro 0,2 μm | Invitrogen | LC2000 | |
| Tampón de corrida Novex Tricina SDS (10X) | Invitrogen | LC1675 | |
| Tampón de transferencia Novex Tris-Glicina (25X) | Invitrogen | LC3675 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | No interferirá con la inmunotinción |
| Solución de tinción roja ATX Ponceau S | Sigma-Aldrich | 09276 | No interferirá con la inmunotinción |
| Bolsas plásticas sellables con calor Kapak para muestras | Fisher Scientific | 0181225AA | |
| Anticuerpo monoclonal de ratón 6E10 contra Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Diluir 1:1.000 hasta 1:5.000 para WB |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Anticuerpo secundario ECL anti-IgG de ratón conjugado con HRP, anti-Aβ (de oveja) | GE Healthcare | NA931-1ML | Diluir 1:10.000 |
| Sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34077 | |
| Película Kodak Biomax MR | Carestream Health | 870 1302 |
Referencias
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in n....
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Reimpresiones y permisos
