En el fraccionamiento subcelular situ de células de mamíferos en cubreobjetos microscopio permite la visualización de la localización de la proteína.
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Artículo de método
En Fraccionamiento subcelular situ de células mamíferas adherentes y no adherentes-
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Resumen
Resumen
Función de la proteína está íntimamente unido a la localización de la proteína. A pesar de algunas proteínas se limitan a una ubicación específica o compartimento subcelular, muchas proteínas están presentes en una población libre difusión de libre cambio con una sub-población que está estrechamente asociada a un dominio particular o de la estructura subcelular. En fraccionamiento subcelular situ permite la visualización de proteína de la compartimentación y también puede revelar proteína sub-poblaciones que se localizan en las estructuras específicas. Por ejemplo, la eliminación de proteínas solubles citoplásmicos y suelto y sujeto proteínas nucleares puede revelar la asociación estable de algunos factores de transcripción con la cromatina. La digestión posterior de ADN en algunos casos pueden revelar asociación con la red de proteínas y ARN que se denominan colectivamente la nuclear andamio o matriz nuclear.
A continuación se describen los pasos necesarios en el fraccionamiento de las células de mamíferos in situ de adherentes y no adherentes en cubreobjetos microscopio. Visualización de la proteína se puede lograr utilizando anticuerpos específicos o proteínas fluorescentes de fusión y microscopía de fluorescencia. Los anticuerpos y / o tintes fluorescentes que actúan como marcadores para los compartimientos o estructuras específicas permiten la localización de proteínas para ser cartografiado con detalle. En el fraccionamiento situ también se puede combinar con el Western Blot para comparar la cantidad de proteínas presentes en cada fracción. Este enfoque bioquímico simple puede revelar asociaciones que de otra manera no se detectan.
Protocolo
I. Preparación para el fraccionamiento
En esta sección se describe la preparación de poli-L-lisina cubreobjetos recubiertos microscopio y la unión de las células antes de su fraccionamiento. Si es necesario que las células pueden ser transfectadas transitoriamente con los vectores de expresión de la proteína, ya sea antes o después de la unión.
A. Preparación de poli-L-lisina cubreobjetos recubiertos
- Prepare una solución de 1mg/ml de poli-L-lisina en agua destilada.
- Capa limpia cubreobjetos con poli-L-lisina, mediante su incubación en la solución de al menos 1 hora en una plataforma oscilant....
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Discusión
Los problemas más comunes y sugerencias:
Todos o la mayoría de las células se pierden durante el lavado. Durante los pasos de líquidos de limpieza debe realizarse lentamente hacia el lado de la placa de 6 pocillos evitando el cubreobjetos. Del mismo modo los líquidos deben ser removidos cuidadosamente inclinando la placa y lentamente pipetear el exceso de líquido. Adhesión celular se puede aumentar el uso de poli-L-lisina cubreobjetos recubiertos.
ADN genómico no es.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Anyaporn Sawasdichai y Nazefah Abdul Hamid muy agradecidos con el Gobierno Real de Tailandia y el Gobierno de Malasia, respectivamente, para doctorado Becas. Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust proyecto de subvención concedida a PSJ y KG. También estamos agradecidos a la Universidad de Bristol Fondo Bioimagen Wolfson.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| BSA | Producto químico | Sigma-Aldrich | A9647-100G | |
| DNasa I | Producto químico | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| poli-L-lisina | Producto químico | Sigma-Aldrich | P-8920 | |
| Tripsina | Producto químico | |||
| EGTA | Producto químico | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| Formaldehído | Producto químico | VWR | 284216N | |
| PIPES | Producto químico | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Sacarosa | Producto químico | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Tritón X-100 | Producto químico | Sigma-Aldrich | T-6876 | |
| Medio de montaje con DAPI | Producto químico | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Reactivo de transfección Fugene 6 | Producto químico | Roche Group | 11814443001 | |
| Histona H1 | Anticuerpos | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-8030 | |
| Lamina A/C | Anticuerpos | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-20681 | |
| Tubulina-α | Anticuerpos | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32293 |
Referencias
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
- Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S.
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Reimpresiones y permisos
