İki Foton Lazer Kaynaklı Nöral Yaralanma: Drosophila Larvalarında Akson Dejenerasyonu ve Yenilenmesini Gözlemleme Yöntemi

Overview

Bu video, bir Drosophila melanogaster larvasında aksonların iki foton lazer ablasyonunu ve yaralanmayı teşvik etmek ve yaralanma bölgesini görüntüleyen örnek bir protokolü açıklar.

Protocol

Bu protokol, Periferik ve Merkezi Sinir Sisteminde Nörorejenerasyon Çalışması için Bir Drosophila In Vivo Yaralanma Modeli olan Li ve ark.'danbir alıntıdır, J. Vis. Exp. (2018).

1. İki foton yaralanması ve Konfokal Görüntüleme

1. Mikroskop kurulumu
   NOT: Bu deney için iki foton lazerli bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanıldı, ancak eşdeğer kuruluma sahip diğer sistemler de yeterli olacaktır. İki fotonlu lazer (930 nm) yaralanma teslimi için, Argon lazer (488 nm) ise GFP'nin konfokal görüntülemesi için kullanıldı.
   1. Her oturumun başında, iki fotonlu lazeri ve/veya konfokal lazerleri ve mikroskobu açın. Görüntüleme yazılımını açın.
   2. İki foton yaralanması için, GFP'yi 930 nm'de (1.950 mW) iki foton lazerle görüntülemek için aşağıdaki parametreleri ayarlayın.
      1. Çizgi tarama modunu seçin. İğne deliğini tamamen aç. Lazer yoğunluğunu ~%20'ye (390 mW) çıkarın.
      2. Çerçeve taraması olarak 512 x 512'yi seçin. Maksimum tarama hızını kullanın (genellikle piksel durma süresi 0,77 μs'dir). Ortalama sayının 1 ve bit derinliğinin 8 bit olduğundan emin olun.
      3. Kazancı ~750 ve uzaklığı 0 olarak ayarlayın.
      4. Bu önceden ayarlanmış deneysel protokolü 2P GFP 930 Ablationolarak kaydedin , gelecekteki deneylerde kolay yeniden kullanım sağlar.
   3. Konfokal görüntüleme için, 488 nm'de Argon lazer ile GFP görüntüleme için aşağıdaki parametreleri ayarlayın:
      1. Edinme sekmesini ve ardından Z yığınınıseçin.
      2. "Laser" altında, 488 nm Argon lazerin gücünü açın.
      3. Kanallar'a gidin, 488 mm lazeri seçin ve lazer gücünü% 5-10'a çıkarın. İğne deliği için 1-2 havadar üniteyi (AU) kullanın. Kazancı 650 olarak ayarlayın.
      4. Alma Modu 'nda,çerçeve taraması olarak 1024 x 1024'ü seçin, maksimum tarama hızını, ortalama 2 sayısını ve 8 Bit bit derinliğini kullanın.
      5. Bu önceden ayarlanmış deneysel protokolü GFP Imaging olarak kaydedin.
2. Dietil eter ve montaj ile larva anestezisi
   1. Dumanlı bir kaputun içine, 15 cm'lik plastik petri kabına 60 mm'lik bir cam tabak yerleştirin. Cam kabın altına bir parça kağıt katlayın ve yerleştirin, ardından dokuya bir üzüm suyu agar tabağı yerleştirin. Kağıt mendilin ıslatıldığı ve tabakta kalan bir sıvı eter tabakasının bulunduğu noktaya, cam kabın içine dietil eter ekleyin. Kapağı her zaman açık tut.
   2. Merkezde bir damla halokarbon 27 yağı ile bir cam slayt hazırlayın. Daha sonra kapak kapağını desteklemek için slaydın dört köşesine 4 nokta vakum yağı ekleyin.
   3. Temizlenmiş bir larvayı almak ve 60 mm'lik cam tabaktaki agar plakasına yerleştirmek için asaları kullanın. Cam kabı kapağıyla örtün ve larva hareket edene kadar bekleyin. PNS yaralanması / görüntüleme için, kuyruğu seğirmeyi durdurur durmaz larvayı dışarı atın. CNS için, tüm larva, özellikle baş segmentleri hareketsiz hale gelene kadar bekleyin.
      NOT: Eter maruziyetinin zamanlaması kritiktir. Bkz. Tartışma.
   4. Uyuşturulma larvasını dikkatlice alın ve slayttaki halokarbon yağının damlasına dik bir şekilde yerleştirin. Slaydın üstüne bir kapak kılıfı ekleyin. Larvaya dokunana kadar kapakçık üzerine bastırmak için hafif basınç kullanın(Şekil 1A).
   5. Larvayı yuvarlamak için örtüsü yavaşça sola veya sağa doğru iterek larvanın konumunu ayarlayın, böylece ilgi alanı nöron / akson / dendrit üstte ve mikroskop lensine en yakın olacaktır.
   6. PNS yaralanması için larva dorsal tarafını yukarı monte edin, böylece her iki trakea da görülebilir. Daha sonra larvayı sınıf III da nöron aksonlarını yaralamak için sola doğru ~ 30 derece yuvarlayın (Şekil 1B ve 1C), sınıf IV da nöron aksonlarını yaralamak için 90 derece (Şekil 1B ve 1E) veya sınıf IV da nöron dendritlerini yaralamak için ~ 30 derece (Şekil 2A).
   7. CNS yaralanması için, larvayı mükemmel bir şekilde ventral tarafta olacak şekilde konumlandırın (Şekil 3A), böylece ilgi alanı z düzlemdeki mikroskop lensine en yakın olacaktır.
3. İki foton lazer ile yaralanma
   1. Slaytı larva ile mikroskop altına yerleştirin ve sahnedeki slayt tutucu ile yerine sabitleyin. Larvayı bulmak için 10X (0.3 NA) hedefini kullanın.
   2. Kapak kılıfına 1 damla objektif yağ ekleyin, 40X (1,3 NA) hedefine geçin ve odağı ayarlayın.
   3. Tarama moduna geçin ve deneysel protokol 2P GFP 930 Ablation'ı yeniden kullanın. İğne deliğinin tamamen açıldığından emin ol.
      NOT: Yapılandırmanın tek tek sistemlere göre optimize edilmesi gerekir.
   4. İlgi çekici bölgeyi (YATıRıMGK) bulmak için Canlı modu başlatın ve uygun yakınlaştırma ile iyi görüntü kalitesi elde etmek için ayarlara ince ayar yapın.
      NOT: Bu adımın amacı, en kaliteli görüntüyü almak yerine, yaralanmak için nöron / akson / dendrit bulmaktır. Bu nedenle, aşırı pozlama veya fotobleaching önlemek için hedef alanı görselleştirmek için yeterli en az ayarları kullanın.
   5. Kırp düğmesinin kullanılabilir hale gelmesi için Canlı taramayı durdurun. Durağan görüntü yol haritası olarak hizmet etsin. Kırp işlevini seçin ve yaralanacak hedefe odaklanmak için tarama penceresini ayarlayın.
   6. Yatırım getirisini olası yaralanma bölgesinin boyutu olacak şekilde azaltın. Örneğin, yaralanmanın hassasiyetini sağlamak ve komşu dokuların hasarını azaltmak için bir akson veya dendritin genişliğini örtmek yeterlidir. İsterseniz, kırpmadan önce yatırım getirisini yakınlaştırın ve daha hassas yaralanmaya izin verin.
   7. Yeni bir görüntüleme penceresi açın. Tarama hızını azaltın ve lazer yoğunluğunu artırın. Canlı modda taranan doku floresan sinyaline göre lazer yoğunluğundaki artışı belirleyin.
   8. Tipik olarak, PNS yaralanması için% 25'ten ve VNC yaralanması için% 50-100'den başlayan iki foton lazer yoğunluğunu ayarlayın. PNS akson yaralanması için lazer yoğunluğunun ~480 mW ve piksel bekleme süresinin 8,19 μs olduğundan emin olun. VNC akson yaralanması için, lazer yoğunluğunun ve piksel bekleme süresinin genellikle sırasıyla 965-1930 mW ve 8,19-32,77 μs olduğundan emin olun.
   9. Sürekli taramayı başlatın. İmleci Sürekli düğmesinin üzerine gelin. Görüntüyü yakından takip edin ve floresanlarda ciddi bir artış gözlenir gözlenmez taramayı durdurun.
      NOT: Floresan başakının ortaya çıkması, yaralanma yerindeki otomatik floresandan kaynaklanmaktadır.
   10. Ayarları yeniden kullanarak Canlı moda geri dönün. Odağı ayarlayarak sadece hedeflenen ilgi çekici bölgeyi bulun.
       NOT: Başarılı yaralanmanın iyi bir göstergesi, yaralanma yerinde küçük bir kraterin, halka benzeri bir yapının veya lokalize kalıntıların ortaya çıkmasıdır.
   11. Bir sonraki nörona geçin ve tek bir hayvanda birden fazla nöronun yaralanması için Adım 1.3.5'ten tekrarlayın. Veya ilk yaralanma yetersizse gücü kademeli olarak artırırken ve/veya tarama hızını azaltırken Adım 1.3.5'i tekrarlayın.
       NOT: Lazer gücünün çok yüksek olması durumunda, yaralanma sonrası canlı tarama görüntüsünde büyük bir hasarlı alan görünecektir. Çok fazla yaralanma larvaların ölümüne neden olabilir.
   12. Kapak kapağını dikkatlice çıkararak ve yaralı larvayı maya macunu ile yeni bir tabağa aktararak larvaları kurtarın. Asgar plakasında birkaç mağarayı asalarla hendekle; alternatif olarak, larvaların plakadan çıkma olasılığını azaltmak için tüm plakayı kullanmak yerine plakada bir agar adası yapın.
   13. Plakayı ıslak dokulu (%0,5 propiyonik asit çözeltisi ile ıslatılmış) ve oda sıcaklığında veya 25 °C'de kültür içeren 60 mm Petri kabına koyun.
       NOT: Larva, 25 ° C'ye kıyasla oda sıcaklığında (22 ° C) yaklaşık bir gün daha larva aşamasında kalacaktır.
4. Yaralanma sonrası konfokal görüntüleme
   1. Yaralı larvaları, larvaları Adım 1.2'deki gibi aynı anestezi ve montaj prosedürünü kullanarak hazırlayarak, daha sonra konfokal lazerle görüntüleyerek istenen zaman noktalarında görüntüleyin.
      NOT: Larvayı yaralanmadan sonra 24 saat (AI) aksonal yaralanmayı doğrulamak için ve rejenerasyonunu değerlendirmek için 48 h AI (sınıf IV da neurons) veya 72 h AI'da (sınıf III da nöronlar) görüntüleyin.
   2. 10X hedefini kullanarak larvayı bulun, ardından 25X (0.8 NA) hedefine geçin. Deneysel protokol GFP Imaging'i yeniden kullanın.
   3. Canlı düğmesine tıklayın ve daha önce yaralanmış aynı nöron bulun.
   4. Canlı tarama penceresinde ilk ve son Z konumlarını ayarlayın. Dur tuşuna basın ve Z yığını görüntüsü almak için Denemeyi başlat'ı tıklatın.
      NOT: Görüntüleri yakalarken bir normalleştirme noktasının (akson yakınsama noktası) dahil edildiğinden emin olun, böylece rejenerasyonun nicelleştirilmesi mümkündür (Şekil 1D, 1F) - bu veri analizi bölümünde daha fazla tartışılır.
   5. Görüntü İşleme'ye geçin, yeni çekilen görüntüyü seçin ve maksimum yoğunluk projeksiyonu oluşturun. Hem z yığınını hem de maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntülerini kaydedin.

Representative Results

Şekil 1: Çevredeki da nöron akson rejenerasyonu sınıf özgüllüğünü görüntüler. (A ve B) Larvaların konumunu gösteren şematik çizim. (C) Sınıf III da nöronların şematik çizimi. (D) 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+ ile etiketlenmiş III da neurons ddaF sınıfının aksonları yeniden büyüyemez. (E) Sınıf IV da nöronların şematik çizimi. (F) PPK-CD4-tdGFP/+ ile etiketlenmiş IV da neurons v'ada sınıfının aksonları lezyon bölgesinin ötesinde yeniden büyür. (D ve F) Kırmızı çizgi akson uzunluğunu gösterirken, yeşil kesikli çizgi hücre gövdesi ile akson yakınsama noktası (DCAC) arasındaki mesafeyi işaretler. Mavi nokta akson yakınsama noktasını işaretler. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Da nöron dendrit rejenerasyon. (A) Sınıf IV da nöronların açıklayıcı gösterimi. (B) Sınıf IV da nöron ddaC'de dendrit rejenerasyonunun ppk-CD4-tdGFP/+ ile etiketlenmiş açıklayıcı gösterimi. Lazer ablasyon birincil dal noktasına hedeflenmiştir ve 48 h AEL'de gerçekleştirilir. 24 saat 24 saat içinde neuritenin AI yaralanması transeksiyon doğrulandı ve 72 h'de AI rejenerasyonu ölçülebilir. DdaC nöronlarının dendritleri, boş alanı döşemek için kopmuş gövdeden filizlenen yeni dendritik dallarla önemli ölçüde yeniden büyüme gösterir. Bu gelişim aşamasında yaralanmamış dendritlere sürekli olarak yeni terminal dallarının eklendiğini belirtmek gerekir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: VNC'de da nöron akson rejenerasyonu. (A) Bir slayta monte edilmiş ve mikroskop altında görüntülenmiş bir Drosophila larvasının şematik çizimi. VNC'deki sınıf IV da nöron aksonları ppk-CD4tdGFP/+ larvada görselleştirildi. Yakınlaştırılmış görüntüde ve şematik çizimde iki aday komiserlik segmenti gösterilir. Her birinin iki yaralanma bölgesi (kırmızı daireler) vardır. (B) Yaralanmadan sonra 8, 24 ve 72 saat (AI) olarak görüntülenen bir yaralı segmentin konfokal görüntüleri. Kırmızı çizgiler yeniden büyüyen aksonları tasvir eder. (C) Yeniden yetişen aksonların ölçümü ve normalleştirilmesi. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent