Overview
이 비디오는 Drosophila 멜라노가스터 애벌레에서 축종의 2 광자 레이저 절제와 부상 부위를 유도하고 이미지하는 예제 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
이 프로토콜은 Li 외에서발췌한 것입니다., 주변 및 중추 신경계에서 신경 재생을 공부하기위한 비보 부상 모델에서 Drosophila, J. Vis. Exp. (2018).
1. 2광자 부상 및 공초점 이미징
- 현미경 설정
참고: 이 실험에는 2광자 레이저가 있는 공초점 레이저 스캐닝 현미경이 사용되었지만, 이와 동등한 설정을 가진 다른 시스템도 충분합니다. 2광자 레이저(930nm)는 부상을 전달하는 데 사용되었고, 아르곤 레이저(488nm)는 GFP의 공초점 영상에 사용되었다.- 각 세션의 시작 부분에서, 2 광자 레이저 및 / 또는 공초점 레이저 (들), 및 현미경을 켭니다. 이미징 소프트웨어를 엽니다.
- 2광자 부상의 경우 930nm(1,950mW)에서 2광자 레이저로 GFP 이미징을 위한 다음 매개 변수를 설정합니다.
- 라인 스캔 모드를 선택합니다. 핀홀을 끝까지 엽니다. 레이저 강도를 ~20%(390mW)로 늘립니다.
- 프레임 스캔으로 512 x 512를 선택합니다. 최대 스캐닝 속도(일반적으로 픽셀 거주 시간은 0.77 μs)를 사용합니다. 평균 수가 1이고 비트 깊이가 8비트인지 확인합니다.
- 게인을 ~750으로 설정하고 오프셋을 0으로 설정합니다.
- 이 미리 설정된 실험 프로토콜을 2P GFP 930 절제로저장하여 향후 실험에서 쉽게 재사용할 수 있습니다.
- 공초점 이미징의 경우 488 nm에서 아르곤 레이저로 GFP 이미징을 위한 다음 매개 변수를 설정하십시오.
- 획득 탭을 선택한 다음 Z 스택을 선택합니다.
- 아래 "레이저", 488 nm 아르곤 레이저에 대한 전원을 켭니다.
- 채널로이동하여 488mm 레이저를 선택하고 레이저 전력을 5-10%로 늘립니다. 핀홀의 경우 1-2 개의 통풍 이있는 장치 (AU)를 사용합니다. 게인을 650으로 조정합니다.
- 획득 모드에서는프레임 스캔으로 1024 x 1024를 선택하고 최대 스캔 속도, 평균 2개 수 및 8비트 깊이를 사용합니다.
- 이 미리 설정된 실험 프로토콜을 GFP 이미징으로 저장합니다.
- 디틸 에테르와 장착유충 마취
- 연기 후드에 60mm 유리 접시를 15cm 플라스틱 페트리 접시에 놓습니다. 유리 접시 바닥에 티슈 페이퍼를 접고 놓고 티슈에 포도 주스 한천 접시를 놓습니다. 티슈 페이퍼가 적신 지점에 다이틸 에테르를 유리 접시에 넣고 접시에 액체 에테르층이 남아 있습니다. 항상 뚜껑을 닫습니다.
- 중앙에 할로카본 27 오일 한 방울로 유리 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드의 네 모서리에 진공 그리스 4점을 추가하여 나중에 커버슬립을 지원합니다.
- 집게를 사용하여 청소된 애벌레를 집어 들고 60mm 유리 접시에 담긴 천지 접시에 놓습니다. 뚜껑으로 유리 접시를 덮고 애벌레가 움직이지 않는 때까지 기다립니다. PNS 부상/이미징의 경우 꼬리가 경련을 멈추자마자 애벌레를 꺼내십시오. CNS의 경우 전체 애벌레가 움직이지 않고 특히 머리 세그먼트가 될 때까지 기다립니다.
참고: 에테르 노출의 타이밍은 매우 중요합니다. 토론을 참조하십시오. - 마취 된 유충을 조심스럽게 집어 들고 슬라이드에 할로카본 오일 한 방울에 머리를 똑바로 놓습니다. 슬라이드 위에 커버슬립을 추가합니다. 부드럽게 압력을 사용하여 애벌레(그림 1A)에닿을 때까지 커버 슬립을 밀어 넣습니다.
- 커버슬립을 왼쪽 또는 오른쪽으로 부드럽게 밀어 애벌레를 굴려 주므로 신경/축산/엔드리트가 현미경 렌즈에 가장 근접하도록 애벌레의 위치를 조정합니다.
- PNS 부상의 경우 애벌레 등쪽을 위로 올려 두 기관모두 볼 수 있도록 합니다. 그런 다음 종아리 ~30도를 왼쪽으로 굴려 병과 III 다뉴런 축슨(도1B 및 1C),90도 부상 클래스 IV 다 뉴런 축손(도1B 및 1E),또는 30도 부상 클래스 IV 다뉴런 펜드리트(도2A).
- CNS 부상의 경우, 유충을 완벽하게 복부측(도 3A)으로배치하여 관심 영역이 z 평면의 현미경 렌즈에 가장 가깝도록 합니다.
- 2광자 레이저로 인한 부상
- 미약체 아래에 애벌레가 있는 슬라이드를 놓고 슬라이드 홀더를 무대 위에 고정시하십시오. 10X(0.3 NA) 목표를 사용하여 애벌레를 찾습니다.
- 커버슬립에 목표 오일 1방울을 추가하고 40X(1.3 NA) 목표치로 전환하여 초점을 조정합니다.
- 스캐닝 모드로 전환하고 실험 프로토콜 2P GFP 930 절제를 재사용한다. 핀홀이 끝까지 열려 있는지 확인합니다.
참고: 구성은 개별 시스템에 따라 최적화되어야 합니다. - 라이브 모드를 시작하여 관심 영역(ROI)을 찾고 설정을 미세 조정하여 적절한 줌으로 좋은 이미지 품질을 달성합니다.
참고: 이 단계의 목적은 최상의 품질의 이미지를 촬영하기보다는 부상을 입을 뉴런 /축산 / 원더 라이트를 찾는 것입니다. 따라서 과다 노출이나 광표백을 방지하기 위해 대상 영역을 시각화하기에 충분한 최소 설정을 사용합니다. - 자르기 버튼을 사용할 수 있도록 라이브 스캔을 중지합니다. 스틸 이미지가 로드맵역할을 하게 합니다. 자르기 기능을 선택하고 스캔 창을 조정하여 부상당한 대상에 집중합니다.
- 부상의 예비 사이트의 크기로 ROI를 줄일 수 있습니다. 예를 들어 축축또는 원더라이트의 너비를 커버하여 부상의 정밀도를 보장하고 이웃 조직에 대한 손상을 줄입니다. 원하는 경우 자르기 전에 ROI를 확대하여 보다 정확한 부상을 허용합니다.
- 새 이미징 창을 엽니다. 스캔 속도를 줄이고 레이저 강도를 증가시킵니다. 라이브 모드에서 스캔된 조직 형광 신호에 기초하여 레이저 강도의 증가를 결정합니다.
- 일반적으로, PNS 부상에 대 한 25%와 VNC 부상에 대 한 50-100%에서 시작 하는 2 광자 레이저 강도 설정. PNS 축사 손상의 경우 레이저 강도가 ~480mW이고 픽셀 거주 시간은 8.19 μs인지 확인합니다. VNC 축사 부상의 경우 레이저 강도와 픽셀 거주 시간이 일반적으로 965-1930 mW 및 8.19-32.77 μs인지 확인합니다.
- 연속 검사를 시작합니다. 커서가 연속 단추 위로 마우스를 가져가십시오. 형광의 급격한 증가가 관찰되는 즉시 이미지를 주시하고 스캔을 중지하십시오.
참고: 형광 스파이크의 출현은 부상 부위의 자동 형광에 기인합니다. - 설정을 다시 사용하여 라이브 모드로 다시 전환합니다. 포커스를 조정하여 타겟팅된 관심 영역을 찾습니다.
참고: 성공적인 부상의 좋은 표시는 작은 분화구의 모습입니다, 반지 같은 구조, 또는 바로 부상 현장에서 지역화 된 파편. - 다음 뉴런으로 이동하여 1.3.5 단계에서 반복하여 단일 동물에서 여러 뉴런을 손상시다. 또는 초기 부상이 부족한 경우 점차적으로 전력을 증가시키고 스캔 속도를 줄이면서 1.3.5 단계를 반복하십시오.
참고: 레이저 전력이 너무 높은 경우 부상 후 라이브 스캔 이미지에서 큰 손상된 영역이 표시됩니다. 너무 많은 부상은 애벌레의 죽음을 일으킬 수 있습니다. - 조심스럽게 커버 슬립을 제거하고 효모 페이스트와 함께 새로운 접시에 부상당한 애벌레를 전송하여 애벌레를 복구합니다. 집게와 함께 한천 접시에 여러 동굴을 도랑; 또는 전체 접시를 사용하는 대신 접시에 한천 섬을 만들어 접시에서 파충소가 기어 나갈 가능성을 줄입니다.
- 접시를 젖은 조직 (0.5 % 프로피오닉 산 용액으로 담근)과 실온 또는 25 ° C의 배양으로 60mm 페트리 접시에 넣습니다.
참고: 유충은 25°C에 비해 실온(22°C)에서 약 1일 더 유충 단계에 남아 있을 것이다.
- 부상 후 공초점 이미징
- 마취와 같은 절차를 사용하여 애벌레를 준비하고 1.2 단계와 같은 장착을 사용하여 원하는 시점에서 부상당한 애벌레를 이미지 한 다음 공초점 레이저로 이미징합니다.
참고: 상술후 24시간(AI)에서 유충을 이미지하여 축산 손상을 확인하고 48h AI(클래스 IV 다 뉴런) 또는 72h AI(클래스 III 다뉴런)에서 재생을 평가한다. - 10X 목표를 사용하여 애벌레를 찾은 다음 25X(0.8 NA) 목표로 전환합니다. 실험 프로토콜 GFP 이미징을재사용한다.
- 라이브 버튼을 클릭하고 이전에 부상을 입은 동일한 뉴런을 찾습니다.
- 라이브 스캔 창에서 첫 번째 및 마지막 Z 위치를 설정합니다. 중지를 누르고 실험을 클릭하여 Z 스택 이미지를 얻습니다.
참고: 재생의 정량화가 가능되도록 이미지를 캡처할 때 정규화 점(축축수렴점)이 포함되어 있는지확인하십시오(그림 1D, 1F)– 이것은 데이터 분석 섹션에서 더 논의된다. - 이미지 프로세싱으로전환하고 방금 촬영한 이미지를 선택하고 최대 강도 투영을 생성합니다. z 스택과 최대 강도 프로젝션 이미지를 모두 저장합니다.
- 마취와 같은 절차를 사용하여 애벌레를 준비하고 1.2 단계와 같은 장착을 사용하여 원하는 시점에서 부상당한 애벌레를 이미지 한 다음 공초점 레이저로 이미징합니다.
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Representative Results
도 1: 주변에서 다뉴런 축삭 재생은 클래스 특이성을 표시한다. (A와 B) 애벌레의 위치를 보여주는 회로도 도면. (C)클래스 III 다 뉴런의 회로도 도면. (D)클래스 III 다 뉴런 ddaF의 축축, 19-12-Gal4로 표시, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, 다시 성장하지 못합니다. (E)클래스 IV 다 뉴런의 회로도 도면. (F)클래스 IV 다 뉴런 v'ada의 축축, ppk-CD4-tdGFP/+로 표시, 병변 사이트를 넘어 다시 성장. (D와 F) 빨간색 선은 축사 길이를 나타내고 녹색 파선선은 세포 체체와 축축 수렴 점(DCAC) 사이의 거리를 표시합니다. 파란색 점은 축축수렴점을 표시합니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 다뉴런 말단 재생. (A)클래스 IV 다 뉴런의 일러스트 표현. (B)ppk-CD4-tdGFP/+에 의해 표지된 클래스 IV 다 뉴런 ddaC에서 원달류 재생의 예시적인 표현. 레이저 절제는 기본 분기 지점을 대상으로 하며 48h AEL에서 수행됩니다. 24h에서 중성염의 AI 부상 횡부가 확인되고, 72hAI 재생이 정량화된다. ddaC 뉴런의 원더라이트는 절단된 줄기에서 발아하여 빈 공간을 타우기 위해 새로운 수지상 가지가 생겨나면서 상당한 재성장을 보여줍니다. 새로운 터미널 지점이 이 발달 단계에서 부상하지 않은 점선에 지속적으로 추가된다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: VNC에서 다뉴런 축축 재생. (A)슬라이드에 장착되고 현미경으로 이미지된 드로소필라 애벌레의 회로도 도면. VNC의 클래스 IV 다 뉴런 축축은 ppk-CD4tGFP/+ 애벌레로 시각화됩니다. 두 후보 commissure 세그먼트는 확대 된 이미지와 회로도 도면에 표시됩니다. 그들 각각에는 두 개의 부상 부위 (빨간색 원)가 있습니다. (B)부상 후 8, 24, 72h로 이미지된 1개의 부상 세그먼트의 공초점 이미지(AI). 빨간색 선은 다시 성장하는 축선을 묘사합니다. (C)재성장 축축의 측정 및 정상화. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous | Acros Organics | AC615080010 | |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | 59-133 | |
| Propionic Acid | J.T.Baker | U33007 | |
| Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544-D | 50 mm X 22 mm |
| Zeiss LSM 880 laser scanning microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Chameleon Ultra II | Coherent |
