Overview
Questo video descrive la ghiandola ad anello Drosophila, una complessa struttura endocrina importante per la biosintesi e la secrezione di ecdysteroidi e altri ormoni. Il protocollo in primo piano dimostra la sua dissezione, fissazione e immunostaining.
Protocol
Questo protocollo è un estratto da Imura et al., Protocolli per la visualizzazione degli organi steroidogenici e dei loro organi interattivi con immunostaining nella Mosca della frutta Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).
NOTA: Lo schema generale dei protocolli è illustrato nella figura 1.
1. La dissezione della ghiandola larvale dell'anello (RG)
NOTA: In D. melanogaster, che appartiene ai Ditteri ciclorrofo, il PG si trova all'interno di un organo endocrino composito chiamato ghiandola ad anello (RG, Figura 2D). Poiché non è possibile che il PG sia separato chirurgicamente da altri tipi di cellule (discusso in seguito), un obiettivo pratico è quello di isolare un RG intatto e integro per dissezione.
- Preparazione delle larve nelle fasi di sviluppo appropriate
NOTA: Per sincronizzare le fasi di sviluppo delle larve di D. melanogaster, è necessario raccogliere le uova entro una finestra di tempo ristretta e raccogliere le larve nei momenti appropriati.- Raccogliere le uova per 2 ore su un piatto di agar succo d'uva a 25 °C.
- Raccogliere le larve di 1st instar appena schiuse sotto un microscopio sezionato con le forcep e trasferirle in una piccola fiala contenente purè di lievito standard / farina di mais fly food.
NOTA: L'età delle larve è rappresentata da "ore dopo la deposizione delle uova (hAEL)", "ore dopo il portello (hAH)" o "ore dopo l'ecdysis L3 (hAL3E)". - Nel momento appropriato, raccogliere le larve messe in scena con un anello di plastica usa e getta per evitare lesioni indesiderate. Per ridurre al minimo una differenza nella progressione dello sviluppo delle 3larve instar rd, raccogliere le 2larve instar a 70 hAEL (48 hAH) e consentire loro di muta a intervalli di 2 ore. Quindi, raccogliere le 3larve di instar entro 2 ore dopo l'ecdisi L3; questa procedura dà 0-2 larve hAL3E.
- Trasferire le larve messe in scena in un piatto pieno di soluzione salina tamponata dal fosfato (PBS).
- Risciacquare le larve con PBS per rimuovere il cibo residuo dal corpo.
- Dissezione grossolana delle larve al microscopio sezionato
- Tenere il gancio della bocca di una larva con le forcep. Sever il corpo larvale all'anteriore un terzo della lunghezza del corpo usando micro forbici.
- Tenere l'estremità tagliata del corpo larvale anteriore con un paio di forcep. Usando l'altra coppia di forcep, spingere delicatamente la punta della testa verso l'interno del corpo; questa procedura trasforma il corpo larvale verso l'interno.
NOTA: Questo passaggio può essere saltato per la dissezione di 1larve di st instar. - Ripetere i passaggi 1.2.1-1.2.2 con larve aggiuntive per 5-10 min.
NOTA: Il numero di larve dovrebbe essere uguale o inferiore a 20 per risparmiare tempo per la dissezione.
- Fissazione e colorazione dei tessuti con immunoistochimica
- Mettere l'un terzo anteriore dei corpi larvali (fase 1.2.2) in un microtubo da 1,5 mL riempito con 500 μL la soluzione fissa (4% di paraformaldeide in PBS). Fissare meno di 20 campioni contemporaneamente, altrimenti PBS collegato ai campioni fissi può causare una diluizione sfavorevole del fissativo. Per la dissezione del raccordo, rimuovere una goccia di PBS e quindi aggiungere una goccia di soluzione fissa.
NOTA: Per la soluzione fissa, può essere utilizzata formaldeide al 3,7% o paraformaldeide al 4%. - Incubare i tessuti sezionati nella soluzione fissa per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) o in alternativa per 2 ore a 4 °C.
- Sostituire la soluzione fissa con 500 μL PBS e risciacquare rapidamente i campioni 3 volte. Lavare i campioni con 500 μL 0,3% PBT (PBS + 0,3% octilfenolo etossilato) per 15 minuti su un rocker a RT. Per la dissezione del raccordo, rimuovere i perni degli insetti e trasferire i campioni in un microtubo da 1,5 mL.
NOTA: Per aumentare la permeabilità degli anticorpi nei tessuti, i campioni vengono trattati con 500 μL 2,0% di PBT per 1-2 ore su un rocker a RT. - Sostituire pbt con soluzione di blocco da 500 μL (albumina di siero bovino al 2% in PBT). Incubare i campioni per 1,5 ore su un rocker a RT.
- Sostituire la soluzione di blocco con 50 μL la soluzione anticorpale primaria, cioè gli anticorpi diluiti nella soluzione di blocco.
- Incubare i campioni durante la notte su un rocker a 4 °C.
- Sostituire la soluzione di anticorpi primari con 500 μL 0,3% di PBT e risciacquare rapidamente i campioni 5 volte. Lavare i campioni 3 volte con 500 μL 0,3% DI PBT per 15 minuti ciascuno su un rocker a RT.
- Sostituire lo 0,3% di PBT con 50 μL la soluzione anticorpale secondaria (anticorpi coniugati a colorante diluiti nella soluzione di blocco). Per la colorazione nucleare, 0,5 μL 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, soluzione stock da 0,1 mg/mL) viene aggiunto alla soluzione a 50 μL. Incubare i campioni su un rocker per 2 ore a RT o in alternativa a 4 °C durante la notte.
NOTA: Tieni i campioni al buio. - Sostituire la soluzione anticorpale con 500 μL 0,3% di PBT e risciacquare 5 volte. Lavare i campioni 3 volte con 500 μL 0,3% DI PBT per 15 minuti ciascuno a RT.
- Mettere l'un terzo anteriore dei corpi larvali (fase 1.2.2) in un microtubo da 1,5 mL riempito con 500 μL la soluzione fissa (4% di paraformaldeide in PBS). Fissare meno di 20 campioni contemporaneamente, altrimenti PBS collegato ai campioni fissi può causare una diluizione sfavorevole del fissativo. Per la dissezione del raccordo, rimuovere una goccia di PBS e quindi aggiungere una goccia di soluzione fissa.
- Dissezione fine del complesso cervello-RG contenente il PG e montaggio
- Utilizzare una pipetta monouso per trasferire i campioni immunostained in un piatto riempito con 0,3% di PBT.
NOTA: Per evitare bolle scomode durante la dissezione e il montaggio, il PBT allo 0,3% può essere sostituito con PBS. - Al microscopio sezionato, tenere la cuticola o il gancio della bocca con un paio di forcep. Usando un ago da 27 G attaccato a una siringa da 1 ml come "coltello", tagliare la punta anteriore dell'esofago e dei dischi per gli occhi per rimuovere il complesso del disco cervello-RG-occhi dalla cuticola del corpo.
- Separare l'esofago e l'intestino dal complesso del disco cervello-RG-occhio con le forcep. Poiché l'esofago passa attraverso il cervello sopra il cordone nervoso ventrale (VNC), estrarre l'intestino sul lato posteriore.
NOTA: Per rimuovere dischi immaginari extra dai campioni, tagliare le connessioni tra il cervello, i dischi per gli occhi e i dischi delle gambe con un coltello ad ago. - Ripetere i passaggi 1.4.1-1.4.4 per altri campioni.
NOTA: Per evitare che i detriti tissutali si attacchino ai campioni, trasferire ogni campione completato in un diverso piatto pulito riempito con PBT o PBS allo 0,3%. - Trasferire i campioni al centro di uno scivolo di vetro pulito con una micropipetta.
NOTA: Per le larvedi 2 ° o 3rd instar, l'estremità di una punta di micropipetta deve essere troncata con una lama di rasoio. - Al microscopio sezionato, allineare i singoli campioni con il loro lato dorsale verso l'alto usando le forcep.
NOTA: Il RG si trova sul lato dorsale del cervello (Figura 2A). Questo allineamento facilita la specifica dei singoli campioni durante l'imaging. - Inclinare uno scivolo di vetro e pulire il PBT in eccesso il più possibile. Mettere una goccia di reagente di montaggio su un lato della diapositiva. Posizionare il bordo di un coperchio scivolare dall'altro lato della goccia e mettere il coperchio scivolare sui campioni lentamente con forcep.
NOTA: Questa procedura impedisce ai campioni di muoversi all'esterno dello slittamento del coperchio. - Conservare i campioni a 4 °C. Tieni i campioni al buio.
- Utilizzare una pipetta monouso per trasferire i campioni immunostained in un piatto riempito con 0,3% di PBT.
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Representative Results
Figura 1: Schema generale dei protocolli. Due distinti metodi di dissezione sono applicabili alle larve e alle femmine adulte, a seconda dello scopo degli esperimenti. I metodi di montaggio sono anche concepiti in base alle condizioni del campione. Le tecniche di fissazione, colorazione e imaging sono fondamentalmente comuni a tutti i campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Visualizzazione dei neuroni pg e pg-projecting. (A e B) Il complesso della ghiandola ad anello cerebrale (RG) della larvainstar di tipo selvaggio 3 rd. In (B), il PG è delineato da linee tratteggiate. La struttura filamentosa tra il cervello e il RG è la trachea. (C-E) L'innervazione del PG è stata vista con mCD8::GFP guidato da GMR45C06-GAL4 nella collezione FlyLight. I neuroni positivi al PG e alla GFP sono stati etichettati rispettivamente con anticorpi anti-Sro (magenta) e anti-GFP (verde). L'immagine fluorescente viene unita all'immagine della luce trasmessa per specificare il contorno dei tessuti. In (D), vengono illustrati il PG, i corpora allata (CA) e i corpora cardiaca (CC). I neuroni che proiettano il PG sono più prominenti nell'immagine ad alta potenza con obiettivo 40X (frecce in E) rispetto all'immagine a bassa potenza con obiettivo 10X (C). Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | The recipe is on the website of Bloomington stock center. | ||
| Dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| Fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| Primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| Secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
