Larvring körtel dissekering: Isolering av utvecklingsmässiga endokrina organ från Drosophila

Overview

Denna video beskriver Drosophila ring körtel, en komplex endokrina struktur viktigt för biosyntes och utsöndring av ecdysteroider och andra hormoner. Det presenterade protokollet visar dess dissekering, fixering och immunostaining.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Imura et al., Protokoll för visualisering steroidogenic organ och deras interaktiva organ med immunostaining i fruktflugan Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

OBS: Det övergripande protokollschemat visas i figur 1.

1. Dissekeringen av larvringskörteln (RG)

OBS: I D. melanogaster, som tillhör cyclorrhaphous Diptera, är PG inom ett sammansatt endokrint organ som kallas ringkörteln (RG, figur 2D). Eftersom det är omöjligt att PG är kirurgiskt separerad från andra typer av celler (diskuteras senare), är ett praktiskt mål att isolera en intakt, oskadad RG genom dissekering.

1. Beredning av larver i lämpliga utvecklingsstadier
   OBS: För att synkronisera utvecklingsstadierna hos D. melanogaster larver är det nödvändigt att samla ägg inom ett smalt tidsfönster och att samla larver vid lämpliga tidpunkter.
   1. Samla ägg i 2 timmar på en druvjuice agar tallrik vid 25 °C.
   2. Samla nykläckta 1^st instar larver under ett dissekerande mikroskop med tång och överför dem till en liten flaska som innehåller mosad standardjäst / majsmjöl flugmat.
      OBS: Larvernas ålder representeras av "timmar efter äggläggning (hAEL)", "timmar efter kläckning (hAH)" eller "timmar efter L3-ekdys (hAL3E)".
   3. Vid lämplig tidpunkt, samla de iscensatta larverna med en engångsplastslinga för att undvika oönskade skador. För att minimera en skillnad i utvecklingsprogression av 3^rd instar larver, samla 2^nd instar larver vid 70 hAEL (48 hAH) och låt dem smälta i 2 h intervaller. Samla sedan de 3^{rd instar} larverna inom 2 h efter L3-ekdysen; denna procedur ger 0-2 hAL3E larver.
   4. Överför de iscensatta larverna till en maträtt fylld med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
   5. Skölj larverna med PBS för att ta bort restmat från kroppen.
2. Grov dissekering av larver under ett dissekerande mikroskop
   1. Håll munkroken på en larva med tång. Skär av larvkroppen i den främre tredjedelen av kroppslängden med hjälp av mikrosax.
   2. Håll den skurna änden av den främre larvkroppen med ett par tångar. Använd det andra tångparet och tryck försiktigt huvudets spets mot insidan av kroppen; Denna procedur vänder larvkroppen ut och in.
      OBS: Detta steg kan hoppas över för dissekering av 1^st instar larver.
   3. Upprepa steg 1.2.1-1.2.2 med ytterligare larver i 5-10 min.
      OBS: Antalet larver bör vara lika med eller mindre än 20 för att spara tid för dissekering.
3. Fixering och färgning av vävnad med immunohistokemi
   1. Lägg den främre tredjedelen av larvkropparna (steg 1.2.2) i ett 1,5 ml mikrorör fyllt med 500 μL fixlösningen (4% paraformaldehyd i PBS). Fixera mindre än 20 prover samtidigt, annars kan PBS som är fäst vid de fasta proverna orsaka en ogynnsam utspädning av fixeringen. För dissekering av filéer tar du bort en droppe PBS och lägger sedan till en droppe fixlösning.
      OBS: För fixlösning kan antingen 3,7% formaldehyd eller 4% paraformaldehyd användas.
   2. Inkubera de dissekerade vävnaderna i fixlösningen i 30 minuter vid rumstemperatur (RT) eller alternativt i 2 timmar vid 4 °C.
   3. Byt ut fixlösningen mot 500 μL PBS och skölj snabbt proverna 3 gånger. Tvätta proverna med 500 μL 0,3% PBT (PBS + 0,3% oktylfenoletoxilat) i 15 minuter på en rocker på RT. För filé dissekering, ta bort insektsstiften och överför proverna till ett 1,5 ml mikrorör.
      OBS: För att öka permeabiliteten hos antikroppar i vävnader behandlas proverna med 500 μL 2,0% PBT i 1-2 timmar på en rocker vid RT.
   4. Ersätt PBT med 500 μL blockeringslösning (2% bovint serumalbumin i PBT). Inkubera proverna i 1,5 timmar på en rocker på RT.
   5. Ersätt blockeringslösningen med 50 μL den primära antikroppslösningen, dvs. antikroppar som späds ut i blockeringslösningen.
   6. Inkubera proverna över natten på en rocker vid 4 °C.
   7. Byt ut den primära antikroppslösningen mot 500 μL 0,3 % PBT och skölj snabbt proverna 5 gånger. Tvätta proverna 3 gånger med 500 μL 0,3% PBT i 15 min vardera på en rocker på RT.
   8. Ersätt 0,3% PBT med 50 μL den sekundära antikroppslösningen (färgkonjugerade antikroppar utspädda i blockeringslösningen). Vid kärnfärgning tillsätts 0,5 μL 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 0,1 mg/ml stamlösning) till 50 μL-lösning. Inkubera proverna på en rocker i 2 timmar vid RT eller alternativt vid 4 °C över natten.
      OBS: Håll proverna i mörkret.
   9. Byt ut antikroppslösningen mot 500 μL 0,3 % PBT och skölj 5 gånger. Tvätta proverna 3 gånger med 500 μL 0,3% PBT i 15 min vardera på RT.
4. Fin dissekering av hjärn-RG-komplexet som innehåller PG och montering
   1. Använd en engångsrör för att överföra de immunstained proverna till en maträtt fylld med 0,3% PBT.
      OBS: För att undvika obekväma bubblor under dissekering och montering kan 0,3% PBT ersättas med PBS.
   2. Håll nagelbandet eller munkroken med ett par tångar under ett dissekerande mikroskop. Använd en 27 G nål fäst vid en 1 ml spruta som en "kniv", skär den främre spetsen av matstrupen och ögonskivorna för att ta bort hjärnan-RG-ögonskivan komplex från kroppen nagelband.
   3. Separera matstrupen och tarmen från hjärn-RG-ögon skivkomplexet med tång. Eftersom matstrupen passerar genom hjärnan ovanför ventral nervkabeln (VNC), dra ut tarmen till den bakre sidan.
      OBS: För att ta bort extra imaginala skivor från proverna, skär anslutningarna mellan hjärnan, ögonskivorna och benskivorna med en nålkniv.
   4. Upprepa stegen 1.4.1-1.4.4 för andra prover.
      OBS: För att förhindra att vävnadsskräp fastnar på proverna, överför varje färdigt prov till en annan ren maträtt fylld med 0,3% PBT eller PBS.
   5. Överför proverna till mitten av en ren glasrutschbana med en mikropipett.
      OBS: För^{2: a} eller 3^rd instar larver, bör änden av en mikropipettespets trunkeras med ett rakblad.
   6. Under ett dissekerande mikroskop justerar du enskilda prover med deras dorsala sida uppåt med hjälp av tång.
      OBS: RG ligger på den dorsala sidan av hjärnan (Figur 2A). Denna justering underlättar specifikationen av enskilda prover under avbildning.
   7. Luta en glasrutschbana och torka av så mycket överflödig PBT som möjligt. Sätt en droppe monteringsreagens på en sida av rutschkanan. Placera kanten på en täcksping från andra sidan droppen och sätt locket på proverna långsamt med tång.
      OBS: Denna procedur hindrar proverna från att röra sig utanför täcksedeln.
   8. Förvara proverna vid 4 °C. Håll proverna i mörkret.

Representative Results

Figur 1: Det övergripande protokollschemat. Två distinkta dissekeringsmetoder är tillämpliga på larver och vuxna honor, beroende på syftet med experimenten. Monteringsmetoderna utformas också efter provförhållanden. Fixerings-, färgnings- och bildteknik är i princip vanliga för alla prover. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Visualisering av PG och PG-projicerande nervceller. (A och B) Hjärnringskörteln (RG) komplexet av vild typ 3^rd instar larva. I (B) beskrivs PG med prickade linjer. Den filamentösa strukturen mellan hjärnan och RG är luftstrupen. (C-E) Innervationen av PG visualiserades med mCD8::GFP driven av GMR45C06-GAL4 i FlyLight-kollektionen. PG och GFP-positiva nervceller var märkta med anti-Sro antikroppar (magenta) och anti-GFP antikroppar (grön), respektive. Den fluorescerande bilden slås samman med den överförda ljusbilden för att specificera konturerna av vävnader. I (D), PG, corpora allata (CA) och corpora cardiaca (CC) illustreras. De PG-projicerande nervcellerna är mer framträdande i högeffektbilden med 40X objektiv (pilar i E) än lågeffektbilden med 10X objektiv (C). Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg collection
tissue culture dish (55 mm)	AS ONE	1-8549-02	for grape-juice agar plates
collection cup	HIKARI KAGAKU
yeast paste	Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice	Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
disposable loop	AS ONE	6-488-01
standard fly food			The recipe is on the website of Bloomington stock center.
Dissection
dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
dissecting microscope	Leica	S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5	Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter)	Shiga Brand		for fillet dissection
micro scissors	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
Fixation
ultrapure water	Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
microtubes (1.5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)	As one	TM-300	rocker
Bovine Serum Albumin	SIGMA	9048-46-8
Primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000	Molecular Probes	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500	SIGMA	S5545
anti-Hts 1B1 (mouse)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20	DSHB	DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50	DSHB	nc82
Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin	Life Technologies	A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	SS7213
Square microscope cover glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent)	Calbiochem	345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)	WATSON	5660-222-1S
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)