C. elegans Blastomere Dissekering: En metod för att ta bort äggskalet och dissociera embryonala celler

Overview

Denna video introducerar en metod för att isolera C. elegans blastomeres från tidiga embryon.  De resulterande cellerna är lämpliga för cellkultur eller ex vivo-experiment.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Hsu et al,   In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads, J. Vis. Exp. (2019).

1. Isolering av embryo blastomere
2. Använd handskar och labbrock för att undvika klippning och kontakt med blekningslösningen.
   1. Håll varje ände av ett mikrokapilleri (kapacitet; 10 μL) med höger och vänster hand.
   2. Dra mikrokapillären mot båda ändarna för att applicera spänning och för kapillärens mitt över en brännare för att göra två handdragna kapillärer (figur 1A).
   3. Trimma spetsarna på de handdragna kapillärerna med tång under det dissekerande mikroskopet och fäst den dragna kapillären i en munrörsapparat. Förbered två typer av pipetter. Spetsöppningsstorlekarna för pipetterna bör vara cirka 2x respektive 1x C. elegansembryon (30 μm) för embryoöverföring och äggskalsborttagning, figur 1B-D).
   4. Pipett 45 μL äggsaltlösning på en brunn av en multiwell-glid(figur 2A; botten).
   5. Placera 5-10 vuxna C. elegans på en brunn som innehåller äggsaltlösning.
   6. För att få tidiga C. elegans embryon, skär vuxna i bitar genom att placera två nålar till höger och vänster om C. elegans kropp och skjuta nålarna förbi varandra ( Figur2A; övre scheman).
   7. Pipett 45 μL hypokloritlösning på en brunn bredvid brunnen som innehåller äggsaltlösning (Figur 2B).
   8. Pipett 45 μL av Sheltons tillväxtmedium på de följande tre brunnarna bredvid brunnen som innehåller hypokloritlösning (Figur 2B).
   9. Överför 1-cellsemp och tidiga 2-cellsembryon till hypokloritlösningen genom munrörning med den handritade kapillären för embryoöverföring (figur 2B).
   10. Vänta till 40–55 s.
   11. Tvätta embryona genom att överföra embryona från hypokloritlösning till Sheltons tillväxtmedium genom munrörning med den handritade kapillären för embryoöverföring (figur 2B).
   12. Tvätta embryona igen genom att överföra embryona till en ny brunn av Sheltons tillväxtmedium genom munrörning med den handritade kapillären för embryoöverföring (Figur 2B).
   13. Överför de tvättade embryona till en ny brunn av Sheltons tillväxtmedium genom munrörning med den handritade kapillären för embryoöverföring. Använd den handritade kapillären för avlägsnande av äggskal, upprepa försiktigt pipetting (Figur 2C; mellersta scheman). Om äggskalet framgångsrikt avlägsnas blir embryonala celler mer sfäriska (Figur 2C; höger).
   14. Separera 2-cellsstegets embryonala blastomerer genom att försiktigt och kontinuerligt pipetting med den handritade kapillären för avlägsnande av äggskal(figur 2D).

Figur 1: Blastomereisolering. A)Handdragning av glas kapillär. B)Handritad kapillär av glas för embryoöverföring. C)Handritad kapillär i glas för avlägsnande av äggskal. D)Ritningar som visar lämplig storlek på kapilläröppningen för avlägsnandet av äggskal. Pilar indikerar embryon. Skalstänger visar 100 μm.

Bild 2: Arbetsflöde för blastomereisolering. (A)Dissekering av vuxen C. elegans i äggsaltbuffert för att få embryon. Fotografier visar 2-cells- och 4-cellsembryon före äggskalsborttagning. B)Hypokloritbehandling och tvättning. C)Schematiken visar lämplig tidpunkt för avlägsnande av äggskal. Fotografi visar ett 4-cells stadium embryo efter äggskal avlägsnande. (D)Blastomere separation. Fotografiet visar ett separerat 2-cellsembryon. Pilarnas storlek i C och D anger de relativa krafter som krävs vid pipetting. Skalstänger visar 50 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.