C. elegans Disección de blastómeros: un método para extraer la cáscara del huevo y disociar las células embrionarias

- Para esta disección, utilice dos micropipetas: una con una abertura aproximadamente del mismo ancho que un huevo y otra que sea el doble de ancha, y una serie de soluciones organizadas en pocillos para facilitar la transferencia rápida entre ellas.

Primero, coloque a los hermafroditas adultos en una solución de sal de huevo, que está osmóticamente equilibrada para evitar que los embriones revienten. Corta los gusanos por la mitad para liberar los embriones en desarrollo.

A continuación, identifique los embriones en estadio de dos células. Estas células son los blastómeros formados por la división del óvulo fecundado. Use la micropipeta con la abertura más grande para transferir un embrión a una solución de hipoclorito, lejía, que comenzará a descomponer la cáscara protectora del huevo.

Después de solo 40 a 55 segundos, transfiera el embrión al medio de crecimiento de Shelton, o SGM. Lave cada embrión brevemente en dos pocillos de SGM para eliminar todos los rastros de lejía antes de colocarlos en un tercer pocillo.

Ahora, use la micropipeta más pequeña para pipetear repetidamente el embrión proporcionando la fuerza mecánica para eliminar la cáscara del huevo y exponer los blastómeros. Continúe pipeteando suavemente el embrión para separar las células blastómeras individuales. En el siguiente protocolo, veremos esta técnica en acción.

- Sujete cada extremo de un microcapilar a una capacidad de 10 microlitros con la mano derecha e izquierda. Tire del microcapilar hacia ambos extremos para aplicar tensión y lleve el centro del capilar sobre un quemador para hacer dos capilares tirados a mano.

Bajo el microscopio de disección, recorte las puntas de los capilares extraídos a mano con pinzas. Realice los dos tamaños de abertura de punta aproximadamente dos veces y una vez la longitud del eje corto de los embriones de C. elegans para la transferencia de embriones y la extracción de la cáscara del huevo, respectivamente.

Conecte el capilar extraído a un aparato de pipeteo bucal. Pipetee 45 microlitros de solución de sal de huevo en un pocillo de un portaobjetos de varios pocillos.

Coloque de 5 a 10 C. elegans adultos en el pozo. Para obtener embriones tempranos de C. elegans, corte los adultos en pedazos colocando dos agujas a la derecha y a la izquierda del cuerpo de C. elegans y deslizando las agujas una sobre la otra.

Pipetee 45 microlitros de solución de hipoclorito en un pocillo junto al pocillo que contiene solución de sal de huevo, y pipetee 45 microlitros de medio de crecimiento de Shelton en los tres pocillos siguientes. Transfiera los embriones en etapa de una célula y los embriones en etapa temprana de dos células a la solución de hipocorito junto a la pipeta bucal con una abertura de mayor tamaño y espere de 40 a 55 segundos.

Lave los embriones transfiriéndolos a los siguientes tres pocillos con el medio de crecimiento de Shelton con 1 a 2 segundos en cada uno de los dos primeros pocillos. Usando el capilar extraído a mano con una abertura de tamaño más pequeño, repita cuidadosamente el pipeteo del embrión para extraer la cáscara del huevo.

Después de eso, pipetee continuamente con el capilar dibujado a mano para separar los blastómeros embrionarios en etapa de dos células.

- Después de retirar la cáscara del huevo, minimice la fuerza en el pipeteo de los embriones hacia arriba y hacia abajo para evitar el estallido.