Una delgada del cráneo ventana Técnica para la crónica de dos fotones En vivo Imágenes de la microglía murina en los modelos de la neuroinflamación

Resumen

Se describe un método para visualizar repetidamente microglia murina y los monocitos circulantes In vivo Más de horas, días o semanas con transcraneal microscopia de dos fotones. Demostramos cómo preparar una ventana adelgazado-cráneo que permite la observación de la microglía en reposo intermitente que puede ser activada por inyección estereotáxica adyacentes del Tat del VIH-1 proteína reguladora.

Resumen

Tradicionalmente, en la neurociencia, en vivo imágenes de dos fotones de la murino sistema nervioso central o bien implicó el uso de ^1,2 abierto el cráneo o calavera adelgazado ^tres preparaciones. Mientras que la técnica del cráneo abierto es muy versátil, no es el óptimo para el estudio de la microglía, ya que es invasivo y puede causar la activación de la microglia. Aunque el enfoque adelgazado-cráneo es mínimamente invasiva, los repetidos re-adelgazamiento de cráneo requiere para obtener imágenes de crónica aumenta el riesgo de lesión de los tejidos y la activación de la microglia y permite un número limitado de sesiones de la imagen. Aquí les presentamos una crónica delgada del cráneo método de la ventana de control microglia murina in vivo durante un período prolongado de tiempo, usando la microscopía de dos fotones. Demostramos cómo preparar una estable y accesible, adelgazada-cráneo ventana cortical (TSCW) con un cubreobjetos se ponga de lo que queda transparente a lo largo de tres semanas de observación intermitente. Esta preparación es mucho más TSCW inmunológicamente inerte con respecto a la activación de la microglia que craneotomía abierta o el cráneo repetidas adelgazamiento y permite un número arbitrario de sesiones de imágenes durante un período de semanas. Preparamos TSCW en CX _{3 CR1} GFP / + ratones de ⁴ a visualizar microglia con aumento de proteína verde fluorescente para ≤ 150 m bajo la superficie pial. También mostramos que esta preparación se puede utilizar en combinación con inyecciones cerebrales estereotáctica de la proteína Tat del VIH-1 neurotóxicos, al lado del TSCW, que es capaz de inducir microgliosis duradero. Por lo tanto, este método es muy útil para examinar los cambios en la morfología y motilidad de la microglia en el tiempo en el cerebro que viven en los modelos de trastorno neurocognitivo asociado VIH (mano) y otras enfermedades neurodegenerativas con un componente neuroinflamatorios.

Protocolo

1. Preparación de los animales de la Imagen

1. En nuestros experimentos, el uso de adultos CX _{3 CR1} ratones GFP / + que expresan GFP en linajes de células mononucleares, incluyendo microglia. ⁴ cepas diferentes de ratones puede ser utilizado para satisfacer las necesidades de un proyecto específico.
2. Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de un cóctel de tres fármacos que consta de 0,05 mg / kg de fentanilo, 5,0 mg / kg de midazolam, y 0,5 medetomidina mg / kg. ⁵ Preparación quirúrgica para TSCW se inicia después de que el animal ya no responde a estímulos dolorosos, como una pizca de cola. A lo largo de la cirugía y la obtención de imágenes, mantener al animal en una almohadilla de calefacción para evitar la hipotermia post-anestesia. Si es necesario, una dosis de refuerzo de un tercio de la dosis original del cóctel anestésico se puede dar a restaurar el original plano anestésico.
3. Cubrir los ojos del animal con un ungüento oftálmico de protección para mantener los ojos húmedos durante la anestesia, que suprime reflejos del animal parpadea. Quitar el pelo del cuero cabelludo de los animales utilizando una navaja de afeitar, tijeras, tijeras, o los métodos químicos. Desinfectar el cuero cabelludo con un 10% de solución de povidona yodada y el 70% de etanol. Todos los instrumentos quirúrgicos deben ser esterilizados en autoclave, esterilizado con un esterilizador de bolas de cristal, o desinfectada con etanol al 70%.
4. Hacer una incisión en el cuero cabelludo con unas tijeras pequeñas, a partir de 4-5 mm de caudal en el cráneo y el avance hacia el frente de los ojos. Es importante que esta incisión ser lo suficientemente larga que la piel no va a interferir con el pegado de la placa de la cabeza que se utiliza para estabilizar la cabeza del ratón durante dos fotones magnética (Figura 1). Identificar el área a ser diluido con un microscopio de disección. Evite las áreas de interés directamente ubicado sobre las suturas craneales, como el cráneo es menos estable en estas áreas y los grandes vasos subyacentes y las meninges puede interferir con las imágenes.
5. Aplicar el 100% de etanol, seguido de 10% de solución de cloruro férrico con un hisopo de algodón estéril para secar las membranas en la parte superior del cráneo y raspar a la basura con unas pinzas finas o una hoja de afeitar. Si no se retiran los resultados de las membranas en la unión inestable la placa de la cabeza.
6. Coloque una capa delgada de la Permabond 910 pegamento alrededor de los bordes de la ventana de visualización por debajo de la placa de cabeza. Coloque la placa de la cabeza recubierta con pegamento sobre el área de interés en el cráneo del animal con una ligera presión (Figura 1). Es importante que la placa de la cabeza sólo está pegada a los huesos del cráneo. Cualquier piel o las membranas que se encuentran atrapados entre la placa de la cabeza y el cráneo disminuye la estabilidad del vínculo. Aplique una pequeña cantidad de acrilato de alrededor de la ventana de visualización con una jeringa al instante de bonos de la cola. Por último, aplique una pequeña cantidad de Loctite 454 a los bordes de la ventana de visualización para evitar fugas.
7. Atornille la placa de la cabeza a la titular de los animales (Figura 1) y comprobar la estabilidad de la placa de la cabeza con un alcance de la disección por la ligera sondeo con un par de pinzas. No debe haber movimiento de la cabeza en relación con la placa de la cabeza. Coloque una gota de solución salina en la ventana de visualización para garantizar que no haya fugas.

2. Preparación de la ventana del cráneo Diluido cortical

1. En preparación para el adelgazamiento del cráneo, seca el cráneo usando una combinación de hisopos de algodón estériles y aire comprimido. Inicialmente delgada del cráneo con una broca de estériles IRF 007 en un simulacro de Microtorque II fijó en 4.000 rpm. Muy suavemente, comienza una zona de adelgazamiento mm 2-2.5 diámetro circular del cráneo. Use movimientos de barrido sólo la luz casi paralelo al cráneo, el uso sin presión a la baja directa. Detener la perforación cada 20-30 segundos para eliminar el polvo de hueso con el aire comprimido. Estas interrupciones en la perforación permiten que el cráneo que se enfríe para que no haya daños inducidos por el calor en el tejido cerebral subyacente.
   1. A medida que la perforación avanza, el aviso de la transición a la capa de hueso esponjoso húmedo (es decir, el "diploe"). Una vez que esta capa se llega a tener cuidado extra con el taladro.
2. De vez en cuando ver la delgadez de la cabeza mediante la colocación de solución salina en el área adelgazada y ver bajo el microscopio de disección. Solución salina también permitirá la disipación del calor. A medida que el cráneo se adelgaza, pequeños vasos se hace visible.
3. Use un MicroBlade dental estéril para alcanzar la final de adelgazamiento en solución salina, como el MicroBlade proporciona información mucho más táctil sobre la estabilidad del cráneo. Esto permite una preparación mucho más delgado que con el ejercicio solo. Desde nuestra experiencia, el grosor del cráneo óptima es de 10-30 micras.
   1. Es importante comprobar la delgadez de la calavera bajo epifluorescencia varias veces durante los primeros intentos de hacer una ventana de cráneo fino. La nitidez y la profundidad de la microglia y los vasos visibles dará una buena indicación en cuanto a cuando la ventana está listo para la imagen.
4. Una vez que la ventana esté listo, pegar un pedazo rectangular de medida de # 0 cubreobjetos wi ª dimensión de menos de 2 mm en cada lado de la ventana. El uso de un 1,0 mm de diámetro pipeta de vidrio, coloque una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato en el área del cráneo adelgazado y cuidadosamente más abajo en la pequeña pieza de cubreobjetos, a continuación, presione suavemente contra el cráneo para expulsar el exceso de cantidad de la cola. Es importante evitar la formación de burbujas entre el vidrio y el pegamento ya que el aire atrapado hará que el área por debajo de convertirse ópticamente opaco. El pegamento de cianoacrilato se utiliza debido a que permanece transparente cuando se seca y también evita que los huesos y la regeneración de membrana manteniendo la cabeza debajo de la ventana delgada y traslúcida. Si hay algún tipo de pegamento en la parte superior de la cubierta de vidrio, utilizar el MicroBlade a extráigala con cuidado una vez que el cristal de la cubierta está en su lugar y la cola se seque.
5. Un analgésico (por ejemplo, buprenorfina 2 mg / kg por vía subcutánea) se administra inmediatamente después de la cirugía y volver a administrarse a cualquier signo de dolor, incluyendo la renuencia a moverse, comer o beber, pérdida de peso, salivación, piloerección, sonidos respiratorios, etc

3. De dos fotones de imágenes

1. En la preparación de dos fotones de imágenes, cubrir el TSCW con solución salina y localizar el área de interés en epifluorescencia (Figura 2). Para habilitar imagen posterior de la zona, tomar una fotografía con una cámara fotográfica.
2. De dos fotones de imágenes, se utiliza una medida de dos fotones con un microscopio ⁶ Ti: Sapphire láser sintonizado a 920 nm. La fluorescencia es detectada mediante el uso de un tubo fotomultiplicador en el modo de detección de todo el campo y un filtro de emisión de 580/180. 20 veces el lente de inmersión en agua (0,95 NA) se utiliza a lo largo de la sesión de imágenes. La potencia máxima de la potencia del láser en el objetivo se encuentra entre 50 y 65 mW.
3. Seleccione un área de interés en las capas corticales I y II (hasta 150 m por debajo de la superficie pial). Para facilitar la re-imagen, tomar fotografías de un mismo campo de visión a 1X, 2X, 3X y zoom digital. Los vasos sanguíneos pueden servir como puntos de referencia para encontrar fácilmente el mismo campo de visión durante las sesiones de formación de imágenes posteriores. En virtud de un zoom de 3X, varios z-series con 80-90 Z-pasos en cada pila y un paso m 0,69 se puede adquirir cada 5 minutos durante 30 minutos, lo que permite una buena muestra de la morfología de la microglia y comportamiento en el tiempo ( Figura 3). Entre las adquisiciones de z-pilas, se debe verificar el nivel de solución salina en los TSCW, así como la profundidad de los animales de la anestesia.

4. La inyección de la neurotoxina del VIH-1, Tat

1. En primer lugar, silanizar el revestimiento interior de una aguja de calibre 35 y 10 l jeringa microvolumen para prevenir la deposición Tat. Retirar la solución silanización (Sigmacote) hasta que se llene la aguja y la jeringa. Permita que la solución reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Vaciar la solución de la jeringa, retire el émbolo y permita que la jeringa y la aguja se seque por completo. Por último, lavar la jeringa y la aguja a fondo con agua destilada.
2. Realizar una craneotomía pequeño de 0,5 mm de diámetro o 3 mm rostral y lateral a la TSCW donde dos fotones imágenes se han obtenido, con una broca pequeña y cuidadosamente adelgazamiento del cráneo, hasta un par de pinzas con puntas afiladas pueden eliminar la capa diluida de los huesos con facilidad. Nosotros usamos una jeringa de 10 l microvolumen equipado con aguja de calibre 35 controlado por una bomba de jeringa Ultramicropump III montado en un micromanipulador de 3 ejes y después de alinear la punta de la aguja de la craneotomía, es cuidado a una profundidad de 700 a 900 micras por debajo de la superficie pial en 3 l Tat _1-72 (u otros agentes pro-inflamatorios) o solución salina (o de control del vehículo) se entrega el 80 nL / min.

5. Animal de Vivienda

1. Si el animal va a ser fotografiada varias veces en un solo día, cubrir el área abierta del cráneo con una mezcla de ungüento oftálmico y vaselina para evitar molestias o daños en el cráneo entre las sesiones de formación de imágenes. Desconecte el puente de apoyo de la pequeña cabeza de la placa (ver Figura 1 B) y colocar el animal en una jaula con comida caliente y agua de fácil acceso. Todos los animales deben ser alojados individualmente después de la cirugía en todo momento. Una vez que las sesiones de formación de imágenes de un animal están completos para un día determinado, retire con cuidado toda la cabeza de la placa y la sutura de la piel sobre el cráneo por el n º 6 o menos de sutura. Una vez más, la casa de los animales por separado con los alimentos de fácil acceso y el agua entre los días experimentales. Compruebe los animales diariamente para detectar cualquier signo de estrés, dolor o infección.

6. Resultados representante

Figura 1. Estabilización de animales para la cirugía y de dos fotones magnética (A) y el diseño de la placa de la cabeza (B).

Figura 2. GFP-etiquetados microglia visualiza con epifluorescencia.

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Figura 3. GFP-etiquetados microglia visualiza con dos fotones de imagen después de la implantación de la TSCW, a unos 50 m por debajo de la superficie pial. El single de dos fotones secciones tomadas de 15-30 minutos después de la implantación de la TSCW (día 0), así como 7 y 17 días después, demuestran que las ventanas se mantiene claro, mientras que la microglía permanecer inactiva en ausencia de insultos inflamatoria. El z-proyecciones tomadas 6 y 24 horas post-inyección de la neurotoxina del VIH tat impresionante exposición cambios morfológicos de la microglía activada. Barra de escala: 10 micras.

Discusión

Existe un creciente consenso de que el sustrato real para el VIH-1 déficits neurocognitivos asociados (mano) es la destrucción de la arquitectura sináptica, presumiblemente causada por mediadores pro-inflamatorios liberados por el VIH-1 fagocitos mononucleares infectadas. Activación de la microglia, células gigantes multinucleadas, y gliosis debido a la hipertrofia astrocíticos se consideran características no específicas del VIH-1 infección y la inflamación en el sistema nervioso central ^7. Por el contrario, la gravedad de la pre-mortem, la enfermedad neurológica se ha relacionado con pérdida de la complejidad sináptica, así como la carga de macrófagos en el sistema nervioso central ^8,9,10,11. Sin embargo, la interacción dinámica entre la microglía, periféricos macrófagos infiltrantes, y de las neuronas en pacientes con la mano, simplemente no puede ser modelado utilizando procesos convencionales estáticos obtenidos de estudios convencionales de inmunohistoquímica. Estudios recientes de nuestro laboratorio han sugerido que al menos algunas de estas interacciones entre las células mononucleares periféricas y centrales y de las neuronas puede ser modelada en parte por la inyección estereotáxica de la epidemia del VIH-1 proteína Tat _1-72 en el parénquima cerebral (Lu, Marker, Tremblay, Qi, y Gelbard, datos no publicados). Por lo tanto, decidió aplicar en vivo imágenes de dos fotones para examinar la interacción entre los macrófagos derivados de monocitos, microglia residente del cerebro y las neuronas, en un modelo animal manejable pequeño para neuroSIDA. Mientras que las preparaciones abierta de cráneo o adelgazado cráneo-pagar un único examen de la arquitectura cortical por un breve período de tiempo (horas), los investigadores interesados ​​en el curso temporal de los eventos subaguda no puede utilizar estos preparados sin artefacto activar microglia / macrófagos debido a la manipulación quirúrgica de la ventana de la bóveda craneal. Aquí se demuestra de una manera simple de evitar estas limitaciones, pegando un pequeño trozo de cubreobjetos de cristal sobre el área del cráneo adelgazado la prevención de la bóveda craneal de la regeneración en el TSCW, así como el mantenimiento de la translucidez de ≥ 3 semanas. Además, demuestran que esta técnica nos permite monitorear el comportamiento de los monocitos periféricos de entrar en la microvasculatura cerebral, así como la microglía del cerebro reside en respuesta a la inyección estereotáxica de VIH Tat _1-72 en la corteza de ratones heterocigotos para CX ₃ CR ₁ / GFP ( para identificar las células mononucleares de linaje). Esta técnica se puede adaptar fácilmente para su uso en ratones con diferentes fondos genéticos, por ejemplo, nosotros usamos heterocigotos CX ₃ CR ₁ / GFP X Thy-1 YFP ¹² ratones para investigar las interacciones entre los derivados de los monocitos macrófagos, microglia residente cerebro y las neuronas en en modelos in vivo de la neuroinflamación relevantes a mano. Nuestra preparación TSCW permite a los investigadores para estudiar interacciones célula-célula entre la periferia y sistema nervioso central que pueden ocurrir en períodos de semanas, en la que puede ser el animal repetidamente la imagen antes y después del tratamiento experimental. Por lo tanto, cada animal puede servir como su propio control. Una advertencia para este modelo TSCW es que las células diana objeto de la investigación deben ser modificados genéticamente para expresar mejor las proteínas fluorescentes (eXFP) o tener una etiqueta con un tinte fluorescente, sin violación mecánica de la bóveda craneal, y que la expresión eXFP debe ser lo suficientemente robusta como para permitir que la arquitectura celular que se visualizan después de las sesiones de imágenes repetidas durante un período de semanas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Citrato de fentanilo	Hospira Inc.
Clorhidrato de midazolam	Baxter Internationl Inc.
Clorhidrato de medetomidina (Domitor)	Pfizer Pharma GmbH
Almohadillas térmicas	Beyond Bodi Heat
Pomada oftálmica de tobramicina y dexametasona (TobraDex)	Alcon
Solución de povidona-yodo al 10%	Betadine Puredue Pharma
Solución de cloruro férrico al 10%	Ricca Chemical Company	3120-32
Metil cianoacrilato 910	Permabond
Cianoacrilato 454	Loctite
Material para dentaduras TEETS con metacrilato de metilo reticulante	Co-Oral-lte Dental Mfg CO
Kit de pieza de mano Microtorque II	Pearson Assessments	R14-0002
Brocas IRF 007	Fine Science Tools	19008-07
Microhoja flexible Norland de radio completo	Salvin Dental	BLAD-NORLAND-69
Cianoacrilato	The Original Superglue
Cubreobjetos de vidrio #0	Electron Microscopy Sciences	63750-01
Jeringa de volumen microlitro de 10 μl	World Precision Instruments, Inc.	ILS010LT
UltraMicroPump III	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1
Aguja NanoFil de calibre 35	World Precision Instruments, Inc.	NL35BL-2
Molinillo de bolas, brocas de carburo #1/4	World Precision Instruments, Inc.	501860
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100
Tubo fotomultiplicador	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Láser de Ti:Zafiro Mai-Tai	Newport Corp.