La cuantificación de ADN de doble filamento se rompe sobre la base de γH2AX focos se ha convertido en una herramienta de valor incalculable, sobre todo en biología de la radiación, para la evaluación de la radiosensibilidad del tejido y los efectos de los compuestos de la radiación modificar. Aquí se demuestra el uso de un ensayo de inmunofluorescencia para la cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido.
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Artículo de método
La cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido
En este artículo
Resumen
Resumen
ADN de doble filamento se rompe (DSBs) son lesiones particularmente letal y genotóxicos, que pueden surgir ya sea por procesos endógenos (fisiológicas o patológicas) o por factores exógenos, particularmente la radiación ionizante y los compuestos radiomimético. La fosforilación de la variante de la histona H2A, H2AX, en la serina-139 de residuos, en el altamente conservadas C-terminal motivo SQEY, formando γH2AX, es una respuesta temprana a las roturas de ADN de doble cadena
Protocolo
Tejidos
- Tejido pulmonar, incrustados en los moldes de la temperatura óptima de corte (OCT) compuesto de 4583, se seccionó (5 micras) con una Leica CM 1950 criostato y montado en poli-L-lisina diapositivas.
Las muestras congeladas se obtuvieron del Dr. Simon Royce en Investigación Infantil Murdoch Institute. El tejido pulmonar se obtuvo de ratones Balb tratada / c ratones y de un modelo de ratón de la enfermedad alérgica crónica vías respiratorias, que muestra muchas de las características patológicas del asma humano 6. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas estableci....
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Discusión
Con el propósito de esta demostración se utilizó tejido de ratón de pulmón de ratones Balb tratada / c ratones y de un modelo de ratón de la enfermedad alérgica crónica vías respiratorias. Hemos cuantificado las diferencias en el número de focos por celda, con un promedio ligeramente superior observada en el pulmón dañado en comparación con las secciones sin tratar. En concreto, la cuantificación se indica 6,5 por focos / celular y el 9,4 por focos / célula (el conteo manual de 20 células por sección), en el tejido si.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
El apoyo del Instituto Australiano de Ciencia Nuclear e Ingeniería se reconoce. TCK es el ganador de premios AINSE. Laboratorio de Medicina epigenómico el apoyo de la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia (566.559). LM con el apoyo de Melbourne de Investigación (Universidad de Melbourne) y de Imágenes Biomédicas becas complementarias CRC. El apoyo de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody y Carmichael Iska) fue muy valiosa para este trabajo. MMT se agradece la asistencia y asesoramiento de la Dra. Olga Sedelnikova de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Se utiliza BSA (1%) para bloquear cualquier unión no específica de anticuerpos. Los anticuerpos primarios y secundarios se diluyen en BSA. | |
| PBS (sin Ca)2+ y Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Compuesto OCT (Optimal Cutting Temperature) 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Láminas Polysine | Menzel-Glaser | SF41296SP | Atrae electrostáticamente secciones de tejido congelado y reduce la necesidad de recubrimientos y adhesivos adicionales. |
| Tween 20 | Reactivo | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0,5 %), es un detergente para permeabilizar células |
| Triton X-100 | Reactivo | Sigma-Aldrich | T8787 | Tritón X-100 (0,1 %) utilizado para permeabilizar las células. |
| Paraformaldehído | Reactivo | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-fosfo-γH2AX (anticuerpo policlonal de conejo) | Anticuerpo primario | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilución del anticuerpo primario (1:500) en BSA al 1 % |
| Alexa Fluor 488 anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo (H+L) | Anticuerpo secundario | Invitrogen | A-11008 | Dilución del anticuerpo secundario (1:500) en BSA al 1 % |
| Etanol (70 %) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAasa A | Reactivo | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reactivo | Vector Laboratories | H-1300 | Un medio de montaje a base de glicerol que contiene yoduro de propidio (un colorante nuclear rojo). Este medio debe utilizarse con un objetivo de aceite que coincida con su índice de refracción. Nota: tinción de ADN comúnmente utilizada: 4,6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI). Solo puede utilizarse con microscopios que dispongan del láser de excitación adecuado. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Cubrebjetes (22x50 mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Frasco Coplin, de vidrio | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Cubeta de tinción | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Microscopio confocal | |||
| CM Leica 1950 Criostato | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software para el análisis de imágenes | Molecular Devices |
Referencias
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S.
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Reimpresiones y permisos
