La inyección de una. Los embriones stephensi para generar la malaria resistente a los mosquitos

Resumen

Los mosquitos Anopheles stephensi son vectores de la malaria que habitan en la India y en toda Asia. Este video muestra la técnica para la realización de micro-inyecciones de esta especie con transgenes que confieren resistencia a la malaria a los mosquitos. Gran parte de la metodología se demuestra en este vídeo es aplicable a las técnicas de microinyección de otras especies de mosquitos.

Resumen

La introducción de genes exógenos en los genomas de los mosquitos requiere técnicas de microinyección adaptados a las especies de interés. Este protocolo de vídeo se muestra un método utilizado por el laboratorio de James microinject construcciones de ADN en embriones Anopheles stephensi para la generación de mosquitos transformado. Técnicas para la preparación de las agujas de microinyección, recolección y preparación de los embriones y la realización de la microinyección se ilustran.

Protocolo

Preparación antes de la microinyección:

1. Los mosquitos la sangre de alimentación: para la inyección de lunes a miércoles en hembras se alimentan del viernes anterior. Para inyectar el jueves y viernes, las hembras se alimentan de lunes de la misma semana.
   
   
2. Prepare las agujas de cuarzo, utilizando el programa 2 y tampón isotónico (ver Materiales).
   
   
3. "Colocación de tubo" de los embriones es la normal vial Drosophila cultura. Algodón húmedo en la parte inferior, con un disco de papel de filtro húmedo que lo cubre.
   
   
4. Prepare cubreobjetos de plástico adhesiva de doble cara de la cinta a un extremo. Cin....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agujas de cuarzo para inyección		Sutter Instrument Co.		Se preparan con tubos capilares de 1,0 mm de diámetro externo, 0,70 mm de diámetro interno y 10 cm de longitud, estirados hasta obtener una punta fina de 3-8 µm y un vástago de aproximadamente 100-300 mm mediante un estirador de micropipetas.
Estirador de cuarzo	Herramienta	Sutter Instrument Co.	P-2000	Configuración: Calor-275, Fil-3, Vel-38, Ret-250, Tracción-141
Kit de plásmido EndoFree		Qiagen
Isopropanol
Columna Millex-GV			SLGV RO4 NL	para limpieza de ADN
ADN del constructo				0,5 mg/ml
Plásmido auxiliar				0,3 mg/ml
Solución de inyección	Tampón			Solución 1x: 5 mM KCl, 0,1 mM fosfato sódico, pH 6,8
Tampón isotónico				ver receta en la sección del protocolo
Aceite desecante				Aceite Halocarbono 700: Aceite Halocarbono 27 (1:1). Mezclar bien. Preparar con antelación a la microinyección.
Sangre				para alimentar a los mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, machos y hembras.
Vial de cultivo de Drosophila				para la puesta de huevos
Placas de Petri				con tampón isotónico, para la eclosión de embriones
Pincel fino				Sable n.º 0000
Papel Whatman 3MM
Pinzas n.º 5
Cinta de doble cara
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscopio		Leica Microsystems		con platina móvil y micromanipulador, ajustado a 10x de magnificación