Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

Resumen

Vamos a demostrar la forma de estudiar el efecto de un único punto de mutación en la función de un canal iónico.

Resumen

Vamos a demostrar la forma de estudiar los efectos funcionales de la introducción de una mutación puntual en un canal iónico. Se estudia la proteína G-dependientes de potasio hacia el interior rectificación (en adelante, GIRK) canales, que son importantes para la regulación de la excitabilidad de las neuronas. Hay cuatro diferentes subunidades de mamíferos canal GIRK (GIRK1-GIRK4) - nos centramos en GIRK2 porque forma una homotetrámero. La estimulación de los diferentes tipos de acoplados a proteínas G-receptores (GPCR), como la de los receptores muscarínicos (M2R), conduce a la activación de los canales GIRK. El alcohol también activa directamente los canales GIRK. Vamos a mostrar cómo la mutación de un aminoácido, específicamente, el cambio de uno o más nucleótidos en el cDNA del canal GIRK. Esta secuencia de ADNc mutado será amplificado en bacterias, purifica, y la presencia de la mutación puntual se confirmó por secuenciación del ADN. El ADNc de la mutante y de tipo salvaje canales GIRK se transfectaron en células embrionarias humanas de riñón HEK293T cultivadas in vitro. Por último, el conjunto de células patch-clamp electrofisiología se utilizarán para estudiar las corrientes de potasio macroscópico a través de los canales GIRK expresó ectópica de tipo salvaje o mutado. En este experimento, vamos a examinar el efecto de una mutación L257W en GIRK2 canales en la activación M2R-dependientes y alcohólicos.

Protocolo

1. Mutagénesis dirigida

Utilizamos la expresión de mamíferos pcDNA3.1 plásmido que codifica para un cDNA de GIRK2 e introducir una mutación puntual utilizando Stratagene (Agilent Technologies) QuikChange XL II dirigida a un sitio kit de mutagénesis, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Secuencia de los cebadores se pueden generar fácilmente mediante el programa de diseño de la cartilla en línea disponible en:
https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15

Nota: el uso estándar de Eppendorf de 1,5 ml en lugar de BD 14 ml tubos descritos en el protocolo. Sin embargo, el uso de XL10-Gold ultracompetent E. coli previamente con β-mercaptoetanol, 30s choque térmico y NZY ⁺ (o NZYM ⁺⁾ los medios de comunicación son fundamentales para el éxito de la mutagénesis. Si es posible, la ingeniería una mutación adicional en silencio que crea un nuevo sitio de restricción puede ser conveniente para la detección de colonias mutantes a continuación.

2. Miniprep, secuenciación de ADN y Maxiprep

2.1 Qiagen minipreparación y secuenciación.

Individual colonias de bacterias se recogen y se cultivaron en caldo LB con ampicilina (AMP). Seguimos las instrucciones del fabricante para la purificación de la DNA. Un resumen simple restricción se puede utilizar confirmar la exitosa introducción de la mutación, si un sitio de restricción se ha incorporado en el paso 1. Secuenciación automática de ADN se realiza fuera del sitio, y es esencial para confirmar la presencia de la mutación en el cDNA, así como evaluar si hay alguna mutaciones no deseadas. Este paso es muy importante. Nos secuencia de la secuencia de codificación de toda la GIRK utilizando adelante promotor T7 y revertir BGH cebadores de secuenciación que flanquean el sitio de clonación múltiple del plásmido pcDNA3.1.

Nota: Es importante inspeccionar cuidadosamente la secuencia electroferograma para asegurar la calidad suficiente de los datos de secuenciación. Electroferograma de alta calidad ha afilado, que no se superponen con los picos de ruido de fondo.

2.2 Qiagen maxiprep.

Seguimos las instrucciones del fabricante.

Nota: Este paso está incluido en nuestros experimentos para mejorar la pureza del cDNA, que nos encontramos es importante para la transfección eficiente.

3. La cultura y la transfección de células HEK293T

Todos estos pasos deben realizarse en una campana de cultivo de tejido estéril.

3.1 de cultivo celular

HEK293T células son convenientes porque son fáciles de la cultura (37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora humidificada), tienen el tiempo de replicación rápida, de alta eficiencia de transfección y son susceptibles de células enteras patch-clamp electrofisiología. HEK293T células expresan el antígeno T SV40 grande que asegura la replicación episomal de plásmido pcDNA3.1.

HEK293T células se cultivan en bajos de glucosa en DMEM los medios suplementados con L-glutamina y el 10% de suero fetal bovino (FBS). Para las células pases, añadir 0,25% de tripsina / EDTA a las células confluentes HEK293T (90-95%), esperar hasta que las células se desprenden de la placa del tejido, y luego se detiene la actividad de la enzima por la adición de medio fresco que contiene FBS /. Placa de ~ 1 X 10 ⁵ células / pocillo en una placa de cultivo de 12 células, junto con 1 ml de medio de cultivo libre de antibióticos por pozo. (1 X 10 ⁵ células se ~ 350 l de suspensión celular obtenida a partir de confluencia T25 frasco resuspendió con 10 ml de medio).

3.2 Transfección

Después de 8.24 horas, las células HEK se adhiere al plástico y están listos para la transfección. Transfectar células con el canal de 0,2 mg cDNA, 0,4 mg M2R receptor cDNA y 0,04 mg YFP cDNA utilizando Invitrogen Lipofectamine 2000. Nota: se utiliza una pequeña cantidad de YFP cDNA para determinar qué células son transfectadas con éxito (células verdes probable que contenga ambos canales GIRK y los receptores M2). La concentración de cDNA utilizar tendrá que ser ajustada para cada clon.

3.3 Visualización de fluorescencia de células transfectadas.

Lugar de 12 y placa en el escenario de un microscopio de fluorescencia invertido, y examinar las células para la expresión de YFP. Compare la imagen de la CID y tome nota del número aproximado de células verdes. Esto proporciona una estimación de la eficiencia de transfección.

3.4 Preparación de los 24 y los platos y poli-D-lisina cubreobjetos recubiertos

Limpia de 12 mm cubreobjetos de vidrio (Warner, CS-12R) agitando durante la noche con ellos Radiacwash, seguido de un lavado con agua destilada y agitación durante la noche en el 95% de etanol. Guarde el cubreobjetos limpios en el 70% de etanol hasta su uso.

Coloque la tapa se desliza en una placa de Petri con etanol, etanol de fuego con las pinzas y el quemador, unad lugar en un pocillo de una placa estéril 24 también.

Cubrir cada pocillo con 250 l de poli-D-lisina (PDL), solución [0,2 mg / ml] y dejar que la cubierta se desliza reposar toda la noche sumergido en una solución estéril PDL bajo el capó. Envuelva la placa de 24 pocillos en Parafilm para evitar la evaporación.

A la mañana siguiente, aspirar y lavar PDL 2x con agua estéril. Deja las placas para secarse bajo el capó, luego cubra. Los 24 platos bien con cubreobjetos recubiertos pueden ser envueltos con papel de aluminio estéril y se almacena a temperatura ambiente durante semanas.

3.5 Revestimiento células transfectadas HEK293T en la cubierta se desliza

24 horas después de la transfección las células, dividida en 24 y plato (~ 4 x 10 ³ células / pocillo) con cubierta de cristal se desliza recubiertos con poli-D-lisina. Nota: Las células transfectadas se puede utilizar hasta 24-72 horas después de la transfección. Las células se dividen para proporcionar hojas individuales cobertura de patch clamp experimentos de electrofisiología.

4. Electrofisiología

4.1 Preparación de Soluciones

Extracelular (bañera) solución: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM CaCl _2, 2 mM de MgCl ₂ y 10 mM HEPES (pH 7,4 conjunto con NaOH).

Alícuota 20K baño de solución y añadir moduladores adecuados

• 20K + Ba ^{2 +:} solución que contiene 1 mM BaCl _2: un inhibidor específico de las entradas de corrientes de rectificar
• 20K + Carbachol: solución con M Carbachol 5: un agonista M2R específicos; parejas M2R a proteínas G que se abren los canales GIRK
• 20K + etanol: baño de solución que contiene 100 mM EtOH para activar los canales GIRK directamente

Soluciones de baño en lugar de jeringas (contenedores de solución) del sistema de intercambio de perfusión rápida. Nota: Usamos una pizca Warner sistema de válvulas de control de las soluciones de baño. Tubería de PE se recomienda.

Internos / electrodo solución: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5,4 mM _MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,4) con 2,5 mM K ₂ ATP y 0,3 M Li ₂ GTP.

Hacemos la solución de electrodos sin ATP y GTP. Hemos separado preparar alícuotas de la ATP y GTP, que se almacenan a -80 ° C, y añadir a la solución de electrodos en el día del experimento. Mantenemos una jeringa con la solución definitiva del electrodo en el hielo para preservar la ATP / GTP. Nos filtro estéril (0,2 micras), las soluciones internas / externas para inhibir el crecimiento microbiano y reducir la posibilidad de obstrucción de las trompas y el electrodo.

4.2 electrodos tira

Usamos Narishige dos pasos tirador vertical y electrodo de vidrio borosilicato de Warner Instrumento (1,5 mm de diámetro exterior, diámetro interior de 0,86 mm y 7,5 cm de longitud) para obtener electrodos con 3.7 mW de la resistencia cuando se llena con solución intracelular.

Nota: Es necesario determinar experimentalmente los parámetros para el extractor de electrodos y el tipo de electrodo de vidrio en el laboratorio. Para nuestro extractor vertical, se utiliza un ajuste de calor de 60,2 para el primer tirón y 43 ~ para el segundo tirón.

4,3 de células enteras patch clamp

1. Monte cubreobjetos en una placa de 35 mm con una pequeña cantidad de vaselina, cubrir con una solución externa y el plato lugar en el escenario de un microscopio de fluorescencia invertido. Use DIC para concentrarse y encontrar las células, cambiar a YFP fluorescencia para localizar YFP células positivas.
2. Posición de la punta del colector de la perfusión cerca de una célula verde (20-30 m de la célula de interés longitud de la fibra = 2.3 de diferencia).
3. Rellene los electrodos con solución, se adhieren a la headstage de Axopatch amplificador 200B (Axon Instruments) con los siguientes valores iniciales: Ganancia 1, Configuración: conjunto de células β = 1, el modo V-clamp.
4. Aplique una presión positiva en el electrodo para evitar la obstrucción de la pipeta, y el uso manipulador de colocar la punta del electrodo justo por encima de la celda.
5. A cero la posibilidad de una pipeta, seleccione el botón de prueba del sello para ofrecer un escalón de tensión de prueba. El paso 5 mV de tensión rectangular aparecerá en la ventana de prueba Sello de Clampex. Ajuste el potenciómetro con una pipeta de desplazamiento en el amplificador para que la línea de base actual a 0 nA. Por otra parte, poner a cero el potencial de la pipeta al cambiar el modo de amplificador de selección para el modo V-track y el mando del metro de Vtrack y utilizar el potenciómetro con una pipeta de desplazamiento en el amplificador para que el voltaje en la pantalla del medidor amplificador a "0.00".
6. Revise la resistencia del electrodo con el comando sello de calidad de la Clampex 8,2 software (debe ser 7.3 MW).
7. Abrir un archivo de protocolo guardado o cree un nuevo protocolo. Para abrir el archivo de protocolo de seleccionar desde el menú principal Adquirir Protocolo luego Abrir y seleccione un archivo de protocolo de tensión salvo. Para este experimento, el protocolo ha sido creada para mantener el potencial de membrana de-40mV, entregar un solo escalón de tensión 50 ms a 100 mV y 40 mV rampa de más de 200 ms. Este protocolo se ejecuta cada dos segundos. El protocolo de rampa permite la observación de la rectificación de una posible regresión y hacia el interior de los canales GIRK. Para los canales iónicos dependientes de voltaje, un escalón de tensión rectangular puede ser más apropiado.
8. Celular con enfoque de ajuste fino del manipulador, de liberación de presión positiva, después de tocar la superficie de la célula aplicar presión negativa, y el monitor aumento de la resistencia en la ventana del osciloscopio Sello de prueba. Una vez que la resistencia está en el rango GΩ, el electrodo se ha sellado en la membrana (Gigaseal ha formado).
9. Aplicar un pulso de presión negativa para romper la membrana celular y tener acceso a la célula. Una vez en la configuración de célula completa, se registrará un aumento corrientes capacitivas.
10. Cambiar a la prueba de membrana en Clampex y anote la resistencia acceso a Ra, Rm resistencia de la membrana, la membrana Cm capacidad y verificar por el ojo de la forma exponencial de la curva teórica a la corriente capacitiva real. Capacitancia de la membrana es proporcional al tamaño de la celda y se utilizará más adelante para calcular la densidad de corriente.
11. Volver al sello de calidad, conjunto V de salida (potencial de membrana) a -40 mV y un filtro de 10 kHz
12. Compensar la capacitancia de la membrana y la resistencia en serie en el amplificador con los siguientes pasos:
    1. Cambie el interruptor de la PAC CELULAR TODO en. Ajuste de la PAC de células enteras y marca resistencia en serie de ida y vuelta, hasta que llegue un pulso de prueba plana. También puede ser necesario ajustar la perilla pipeta de capacidad de la PAC FAST.
    2. Gire la perilla% de predicción para aproximadamente el 60-80%, una vez más re-ajuste de la PAC de células enteras y el dial de la resistencia en serie (es posible que tengas que ajustar la capacitancia pipeta una rápida compensación mando de la PAC también).
    3. Encienda% COMP-al 100% sin oscilación de la célula, mientras trata de mantener el pulso de plano por el reajuste de la PAC de células enteras y la resistencia en serie (es posible que tengas que ajustar la capacitancia pipeta mando de compensación de la PAC rápido también). Ajuste el retraso por la reducción de la constante de tiempo.
    4. Anote los valores de Cm (capacitancia de la membrana), R (resistencia en serie), COMP%, PRED% y el tiempo de retardo establecido en el amplificador en el cuaderno. El CM y R debe ser aproximadamente la misma que la Cm y Rm medido en la prueba de la membrana de arriba.
13. En la válvula de solución externa para controlar la solución del baño. Ajuste el amplificador de 8 polos del filtro de Bessel a 2 kHz, abra un protocolo de fijación de voltaje y corrientes comenzar la grabación.
14. Registramos corrientes GIRK utilizando un protocolo de rampa que los pasos a -100 mV a 50 ms y después de las rampas de 100 mV a 40 mV más de 200 ms y se entrega cada 2 segundos. El protocolo de rampa permite la observación del potencial de inversión y la propiedad de rectificación hacia el interior de los canales GIRK. A temperatura ambiente (22-25 ° C), la GIRK actual debe invertir cerca de -50 mV (con KCl 20 mM en el baño), que está cerca del potencial de equilibrio calculado para K (E _K = -50 mV), entonces quedan bastante plana a potenciales positivos a E _K.
15. Protocolo experimental: Después de grabar una línea de base estable, cambie a la solución de 20K + Carbachol y esperar a pico de la respuesta, vuelva a la solución de baño de 20K, a continuación, aplicar 20K + etanol y esperar la respuesta de pico, y luego cambiar a la solución del baño 20K, y finalmente 20K + Ba ^{2 +} solución. Durante la aplicación de estos medicamentos que se producirán cambios en la amplitud de GIRK corrientes (más pronunciada a -100 mV). Anote el número de traza correspondiente a la aplicación de diferentes soluciones extracelular en el cuaderno. Un archivo de Clampfit single contendrá todos los barridos de todo el experimento.

5. Análisis de Datos

Usamos Clampfit 9.2 de software para analizar los datos de las corrientes GIRK a -100 mV.

1. Abra el archivo con la grabación, sitúa el cursor a -100 mV. Por defecto, se podrá ver todos los vestigios superpuestos en la pantalla. Pulsando el botón "Escribir cursores" icono que va a crear hojas de cálculo tipo Excel con datos numéricos.
2. X por asignar a la columna número de seguimiento y Y a la columna del cursor y pulsar "Crear gráfico" icono usted puede dibujar un gráfico de tiempo-curso del experimento.
3. Calcular basal actual restando actual en presencia de Ba ^{2 +} de la corriente registrado en la solución de perfusión externos solo ("actual 20K" menos "20K + Ba ^{2 +} actual"). Calcular las corrientes inducidas por restar actual basal de 20K de las corrientes activadas ("20K + Carbachol actual" menos "20K actual", "20K + etanol actual" menos "actual 20K"). Calcular la densidad de corriente (pA / pF), dividiendo el actual capacitancia de la membrana (leer directamente desde el amplificador). Calcular la activación por ciento al dividir las corrientes inducidas por las corrientes de base y multiplicando por 100.

6. Resultados representante

Usted debe ser capaz de registro actual de las células transfectadas con los canales de tipo salvaje. Para medir los canales GIRKd en la solución extracelular que contiene 20 mM de K ⁺ (y 145 mM de K ⁺ intracelular) que debe exhibir rectificación fuerte hacia adentro y un potencial de inversión de ~ -50 mV, que es una propiedad esencial de los canales de potasio. La corriente de tipo salvaje se incrementará en gran medida de aplicación de carbacol (3-5 veces más que basal actual) y responden de manera similar a la de etanol 100 mM. Nota: la convención de signos para electrofisiología es que la corriente hacia el interior es negativo y la corriente hacia el exterior es positiva. Para la mutación L257W en el bolsillo de unión de alcohol GIRK2, podrás ver las respuestas atenuadas tanto carbacol y el etanol. Esto sugiere que la L 257 está implicado en el alcohol y la activación de la proteína G de GIRK2 canales. Para más ejemplos de los resultados de GIRK2 mutagénesis, vea la publicación reciente de Aryal et al. ^1.

Figura 1. Ventana de Clampfit 8.0 muestra el archivo de datos para el registro de GIRK2 de tipo salvaje. Izquierda del panel superior muestra superpuesta barre registrado en respuesta a un protocolo de rampa de voltaje en la presencia de diferentes soluciones externas bah. El cursor se coloca en un -100 mV. Los valores de cursor se escriben en la hoja de cálculo (panel derecho). Panel inferior izquierdo muestra la representación gráfica del número de barrido frente, actual. Tenga en cuenta el aumento de la corriente (flecha hacia abajo) con etanol (EtOH) y carbacol (CARB) y la inhibición de la corriente con Ba ^{2 +.}

Figura 2. Descripción de la ventana de Clampfit 8.0 muestra el archivo de datos para un mutante GIRK2-L257W grabación. Son los mismos que en la Figura 1. Tenga en cuenta la pérdida de carbacol (CARB) y la reducción de la activación de EtOH-corrientes inducidas en los canales de mutantes.

Discusión

La mutagénesis dirigida es un método clásico para estudiar relaciones estructura-función de los canales iónicos. Se basa en la premisa de que al cambiar un residuo crítico de los canales iónicos uno debe ser capaz de observar los cambios pronunciados en la función del canal. Por el contrario, muchas mutaciones que no son críticas en la posición pueden ser introducidos sin perturbaciones importantes en la función del canal. Por lo general, el residuo en cuestión es la primera mutación a alanina, una pequeña organización no polares de aminoácidos, seguida por la mutación de triptófano, el más grande de los aminoácidos ^2. Si el residuo es importante para la función del canal, ambas mutaciones se va a cambiar la actividad del canal. Si un residuo menos esencial está mutado, los efectos de la mutación, especialmente a la alanina son a menudo insignificantes. Mutaciones triptófano son más propensos a causar cambios debido a los obstáculos estéricos asociados con el tamaño de triptófano. A menudo, cuando la información estructural que falta, la mutación sistemática a alanina y triptófano dentro de un fragmento de un canal (llamado alanina o escanear triptófano) puede ser utilizado para localizar restos críticos. Es importante señalar que varios clones con diferentes mutaciones puntuales se pueden preparar en paralelo que permite probar múltiples residuos dentro de un tiempo relativamente corto. Recientemente, múltiples estructuras cristalinas de los canales se han convertido en disponibles ^3,4,5. Se pueden utilizar para proponer posibles residuos clave para ser probados utilizando el procedimiento descrito en este protocolo.

Las mediciones de tipo salvaje del canal debe acompañar siempre a la medición de un canal de mutantes para servir como un control positivo para asegurar que los experimentos de transfección y electrofisiológicos se realizaron correctamente. Las mutaciones puntuales pueden conducir a la falta de una corriente funcional, similares a la regulación actual de tipo salvaje o alteración de la actividad del canal. La falta de corriente medible puede ser debido al tráfico indebido de plegado o alterada. En tal caso, puede ser útil para averiguar si el canal de tráficos correctamente a la superficie mediante un ensayo de inmunofluorescencia biotinilación o contra etiqueta extracelular (sin permeabilización celular) para distinguir entre los no funcionales de canales en la membrana plasmática y los canales de retenido en el interior de la célula . Por último, es aconsejable investigar no sólo la actividad basal del canal, sino también las consecuencias de la mutación en la regulación del canal. Diferentes mecanismos de modulación de la función del canal podría estudiarse en función del canal iónico de interés, incluyendo la regulación de las proteínas G, PIP2, iones, la concentración de ATP, la fosforilación (con tirosina, serina treonina o mutación), ubiquitinación o sumoylation (con la mutación de lisina) y abridores de canal directo o bloqueadores.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Productos químicos	Sigma	Varía
Kit de mini preparación	Qiagen	27104
Radiacwash	Biodex	005-100
Hidrobromuro de poli-D-lisina	BD Biosciences	CB40210	También se puede usar poli-L-lisina
Kit de maxi preparación	Qiagen	12263
Kit QuickChange XL II de mutagénesis dirigida	Stratagene	200512-5
Lipofectamina 2000	Invitrogen	11668-027
Cubreobjetos ˆ… 12 mm	Warner Instruments	CS-12R
Tubo capilar de vidrio de borosilicato – pared estándar	Warner Instruments	G150-3
Microscopio invertido de fluorescencia	Leica	DMI3000 B
Electrofisiología	Nikon/ Leica/ Zeiss	Cualquier microscopio invertido DIC (Hoffmann) con fluorescencia
Amplificador	Molecular Devices	Amplificador Axon Axopatch 200B
Sistema de perfusión	Warner Instruments	Sistema de perfusión VC-6 MM-6
Digitalizador	Molecular Devices	Digitalizador Digidata 1320
Manipuladores	Sutter Instruments	Manipulador: MP-85
Extractor de electrodos	Narishige	Extractor vertical de electrodos PC10
Mesa de aislamiento	Technical Manufacturing Corporation	Mesa de aire