Evaluación de la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes

Summary

El análisis microscópico de γH2AX focos, que forman después de la fosforilación de H2AX en la Ser-139 en respuesta a ADN de doble filamento se rompe, se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología de la radiación. Aquí hemos utilizado un anticuerpo mono-metílico de la histona H3 lisina 4 como marcador epigenético de la eucromatina activa la transcripción, para evaluar la distribución espacial de la radiación inducida por la formación de γH2AX dentro del núcleo.

Abstract

Una primera respuesta molecular a roturas en el ADN de doble cadena (DSB) es la fosforilación de la Ser-139 de residuos en el motivo SQEY terminal de la histona H2AX ^1,2. Esta fosforilación de H2AX está mediada por la fosfatidil-inosito 3-quinasa (PI3K), la familia de las proteínas, la ataxia telangiectasia mutada (ATM), el ADN-proteína de la subunidad catalítica y la quinasa ATM y RAD3 relacionadas con ³ (ATR). La forma fosforilada de H2AX, conocido como γH2AX, se extiende a las regiones adyacentes de la cromatina en el sitio del OSD, la formación de focos discretos, que son fácilmente visualizados por microscopía immunofluorecence ^3. Análisis y cuantificación de γH2AX focos ha sido ampliamente utilizada para evaluar la formación de OSD y la reparación, en particular en respuesta a la radiación ionizante y para la evaluación de la eficacia de la radiación y varios compuestos de la modificación de los compuestos citotóxicos ^4.

Dada la especificidad y la sensibilidad exquisita de este marcador de novo de DSBs, ha proporcionado nuevos conocimientos sobre los procesos de daño y reparación del ADN en el contexto de la cromatina. Por ejemplo, en biología de la radiación del paradigma central es que el ADN nuclear es el objetivo fundamental con respecto a la sensibilidad a la radiación. De hecho, el consenso general en el campo ha sido en gran parte para ver la cromatina como un modelo homogéneo de los daños y reparación del ADN. Sin embargo, con el uso de γH2AX como marcador molecular de DSBs, una disparidad en γ-inducida por irradiación formación γH2AX focos en la eucromatina y heterocromatina se ha observado ^5-7. Recientemente, hemos utilizado un panel de anticuerpos para cualquier mono-, di-o tri-metilación de histonas H3 en la lisina 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) que se imprime epigenética de la heterocromatina constitutiva y silenciamiento transcripcional y la lisina 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), que están estrechamente correlacionados activa la transcripción de las regiones eucromática, para investigar la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes ^8. De acuerdo con las ideas dominantes sobre la biología de la cromatina, nuestros resultados indican una estrecha correlación entre la formación de γH2AX y activa la transcripción ^9. Aquí demostramos nuestro método de inmunofluorescencia para la detección y cuantificación de γH2AX focos en las células no adherentes, con especial hincapié en la co-localización con otros marcadores epigenéticos, análisis de imágenes y modelos 3D.

Protocol

Preparación de células

1. Eritroleucemia humana K562 células se cultivan en medio RPMI-1640 suplementado con 10% (v / v) de suero fetal bovino y 20 mg de gentamicina / ml en un humidificado _5% de CO2 el medio ambiente a 37 ° C.
2. Aproximadamente 18 horas antes de la tinción de las células en crecimiento exponencial de lavado (óptima a 5 x 10 ⁵ células / ml) con tampón fosfato salino (PBS), se resuspenden en medio fresco y volver a 37 ° C, 5% de CO _2.
3. Lavar las células dos veces con PBS por centrifugación a aproximadamente 1500 rpm durante 5 minutos y resuspender en medio fresco.
4. Recuento de células ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Medio de crecimiento	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medio suplementado con 10% (v/v) fetal bovino, 2mM L-glutamina, 20μ g/ml gentamicina, 20mM (HEPES) Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etansulfónico
Suero fetal bovino (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Albúmina sérica bovina (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) se utiliza para bloquear cualquier unión de anticuerpos inespecífica. Los anticuerpos primarios y secundarios se diluyen en BSA.
PBS (sin Ca2+ y Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Azul		Sigma-Aldrich	T6146	Se utiliza para distinguir entre células vivas y muertas.
Tritón X-100	Reactivo	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0,1%) utilizado para permeabilizar células.
Reactivo de paraformaldehído		Sigma-Aldrich 158127		Paraformaldehído (4%) utilizado para fijar células.
Anticuerpo monoclonal anti-histona H2AX monoclonal de ratón	Anticuerpo primario	EMD Millipore	16193	Dilución del anticuerpo primario (1:500), en BSA al 1%.
HistonH3 (Mono-metil K4)	Anticuerpo primario	Abcam	AB8895
Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG (H+L)	Anticuerpo secundario	Invitrogen	11029	Dilución de anticuerpo secundario (1:500), en BSA al 1%.
Alexa Fluor 546 cabra anti-conejo IgG (H+L)	Anticuerpo secundario	Invitrogen	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	TOPRO3 es un colorante de ADN con un Abs/Em de 642/661 nm. DAPI podría utilizarse si el microscopio confocal está equipado con un láser de 405 nm.
ProLong Gold	Solución antidecoloración	Invitrogen	P36930	Este medio de montaje a base de glicerol debe usarse con una lente a base de aceite que coincida con su índice de refracción.
Portaobjetos de		Menzel-Glaser
Cubreobjetos (22x50mm)	Cubreobjetos	Menzel-Glaser	CS2250100
Matraz de cultivo de tejidos,	matraz de cultivo	BD Biosciences 353112
Shandon Cytospin 4		Thermo Fisher Scientific, Inc.
Citoembudos		Shandon, Inc.
Tarjetas de		Shandon, Inc.
Frasco Coplin, vidrio		Grale Scientific P/L	1771-OG
Canal		Grale Scientific P/L	V1991.99
Pluma		Zymed Laboratories, Inc.
Irradiador Gammacell 1000 Elite Irradiador	Gamma	Nordion International Inc.
Microscopio			Confocal Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Equipado con 3 láseres: 488 nm, 543 nm y 633 nm.
Metamorph	para el análisis de imágenes	Dispositivos moleculares