Cryopreserving e recupero di cellule umane iPS usando KnockOut Completa alimentatore-Free siero sostituzione Media

Summary

Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per cryopreserving cellule umane iPS nel medio KnockOut crioconservazione SR ed il recupero di queste cellule in completo alimentatore KnockOut gratuito SR (KSR-FF), medio o alimentatore a base di medie SR KnockOut.

Abstract

La scoperta nel 2006 che fibroblasti umani e mouse potrebbe essere riprogrammato per generare cellule iPS ^1-3 con caratteristiche molto simili alle cellule staminali embrionali ha creato una nuova fonte preziosa di cellule pluripotenti per la scoperta di farmaci, terapia cellulare, e la ricerca di base.

Mezzi di comunicazione GIBCO e reagenti sono stati in prima linea nella ricerca sulle cellule staminali pluripotenti da anni. Knockout DMEM integrato con sostituzione Knockout siero è il media di scelta per la crescita delle cellule staminali embrionali e ora di cellule iPS cultura ^3-9. Il gold standard del sistema dei media può ora essere utilizzato per alimentazione priva di cultura con l'aggiunta di Cocktail SR Factor Knockout crescita.

Tradizionale ES umane e metodi di coltura delle cellule iPS richiedono l'uso di mouse o strati alimentatore fibroblasti umani, o l'alimentatore condizionata media. Questi metodi sono cultura alta intensità di lavoro, difficili da scalare ed è difficile mantenere anche le cellule indifferenziate a causa delle condizioni indefinito. Invitrogen ha sviluppato SR Knockout Cocktail fattore di crescita per consentire di transizione facilmente i fianchi e le colture cellulari hES alla rinfusa, senza pur mantenendo l'uso di SR Knockout.

Protocol

Nota: Per mantenere condizioni di coltura sterili, tutte le procedure descritte in questo protocollo sono effettuate utilizzando pratiche di laboratorio sterile e condotto sotto una cappa a flusso laminare.

Prima di iniziare, assicurarsi che i media sono equilibrati a 37 ° C e opportunamente gasati.

Preparazione Geltrex rivestita Piatti Cultura

Nota: vedi appendice per l'uso di piatti CELLstart cultura rivestito.

1. Scongelare un tubo di Geltrex (1 ml) lentamente a 2-8 ° C e diluire 1:100 in 99 ml di Knockout D-MEM/F-12. Mescolare delicatamente la soluzione.
   
   Nota: alcune linee di cellule iPS possono richiedere una diversa diluizione Geltrex per una crescita ottimale. Vedi appendice per le diluizioni alternative.
2. Coprono l'intera superficie di ogni piatto cultura con la soluzione Geltrex (1 mL per un piatto da 35 mm, 1,5 ml per un piatto di 60 mm).
3. Sigillare ogni piatto con Parafilm contro l'essiccamento e incubare i piatti per 1 ora a 37 ° C.
   
   Nota: A questo punto si può memorizzare il Geltrex rivestite piatti di cultura a 4 ° C per un massimo di 1 mese. Sigillare ogni piatto con Parafilm per evitare che il Geltrex si secchi.
4. Prima di utilizzare, trasferire il Geltrex rivestite piatti di una cappa a flusso laminare e permettere loro di equilibrare a temperatura ambiente (circa 1 ora).

Preparazione completa alimentatore-Free SR KnockOut Media

1. Per preparare 1 mL di 10 mg / ml soluzione di base FGF, asettico miscelare i componenti elencati di seguito. Aliquota della soluzione e conservare a -20 ° C fino a 6 mesi.
   

   Di base FGF	10 mcg
   D-PBS	990μL
   10% di BSA	10 L

   
   Nota: BSA può essere sostituito con HSA o SR Knockout alla stessa concentrazione.
2. Per preparare 50 ml di 2 mg / ml soluzione dispasi, asettico miscelare i componenti elencati di seguito. Filtrare la soluzione sterilizzare e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane.

   Dispasi	100 mg
   D-PBS	50 mL

3. Per preparare 100 mL di SR KnockOut completo alimentatore-Free (KSR-FF) asetticamente combinare i componenti elencati nella tabella sottostante.
   

   Componente	Concentrazione magazzino	Concentrazione finale	Volume
   Knockout DMEM/F12 (n ° cat. 12660-012)	-	1X	76,8 mL
   GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)	200 mM	2 mM	1 ml
   KnockOut SR (n ° cat. 10828-028)	-	20%	20 ml
   KnockOut SR-GFC (n ° cat. A10580-01)	50X	1X	2 ml
   bFGF (n ° cat. PHG0024).	10 mcg / ml	20 ng / mL	200 l

   
   Si può memorizzare il KSR-FF medio a 2-8 ° C per un massimo di una settimana.
4. Poco prima di pre-raggiunga l'equilibrio completo a temperatura e gas, in modo asettico aggiungere il volume richiesto di 2 mercaptoetanolo (55 concentrazione magazzino mm) per una concentrazione di 0,1 mM finale. Ad esempio, per preparare 100 ml di KSR-FMedio F aggiungere 182 microlitri di 55 mM di 2-mercaptoetanolo (diluizione 1:550) In alternativa, il 2-mercaptoetanolo possono essere aggiunti al mezzo di 1X completato e conservato a 2-8 ° C per un massimo di una settimana.

Preparazione di congelamento / Crioconservazione Media

Il mezzo di crioconservazione è composto da due mezzi di comunicazione; Media congelamento A e B. Media congelamento Essi sono aggiunti alle cellule in tempi diversi e devono rimanere separati. Ciascuno di essi è il 50% del volume totale delle medie Crioconservazione necessario. Il volume totale delle medie Crioconservazione necessario è di 1 ml per ogni flacone da congelare. Un 90% piatto confluenti 60mm hESC può essere utilizzato alla banca 2 flaconi di hESC nei media crioconservazione.

Preparare un volume sufficiente di ogni media di congelamento con un extra di 2-5mL per assicurare eccedenza.

Congelamento Media A (50% del volume finale):	50% DMEM/F12	50% KSR
Congelamento Media B (50% del volume finale):	80% DMEM/F12	20% di DMSO

Esempio:

Se siete congelamento 20 fiale di cellule, avrete bisogno di 20 mL di media crioconservazione. Aggiungere 4 ml di carico eccessivo per un totale di Media Crioconservazione 24ml. Ciò significa che avrete bisogno di 12 ml di Media congelamento A (50% di 24ml) e 12 ml di B Media di congelamento (50% di 24ml).

Congelamento Media A (12 ml):	6 ml DMEM/F12	6 ml KSR
Congelamento Media B (12 ml):	9,6 mL DMEM/F12	2,4 mL di DMSO

La composizione finale del Medio Crioconservazione DMEM/F12 è del 65%, 25% KSR, e il 10% di DMSO.

Cryopreserving iPSCs

1. Preriscaldare il volume richiesto di dispasi in un bagno d'acqua a 37 ° C. Fare riferimento alla Tabella 1 riportata di seguito per i dettagli sui volumi richiesti.
2. Pre-equilibrare il volume di KSR-FF in A ° C 37 bagnomaria per 15 min. Fare riferimento a 1below tabella per i dettagli sui volumi richiesti.
3. Aspirare il terreno trascorso dalla nave cultura con una pipetta, e lavare le cellule due volte con D-PBS.
4. Aggiungere delicatamente preriscaldato soluzione dispasi alla nave cultura (ad esempio, 1 mL di soluzione dispasi per 60 mm piatto di cultura). Agitare il recipiente di coltura per ricoprire l'intera superficie delle cellule.
5. Incubare il recipiente di coltura a 37 ° C per 3 minuti.
6. Rimuovere il recipiente dal termostato, aspirare la soluzione dispasi, e lavare delicatamente le cellule con D-PBS.
7. Raschiare delicatamente le cellule dalla superficie del piatto cultura utilizzando un raschietto cellula, e trasferire le cellule in una provetta sterile centrifuga 15ml.
8. Lavare il piatto cultura due volte con KSR-FF, dolcemente "spruzzo off" tutte le cellule che non si sono staccati. Piscina di risciacquo medio con le cellule nel tubo 15ml.
9. Centrifugare la provetta a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente per agglomerare le cellule.
10. Con attenzione aspirare il sopranatante senza disturbare il pellet di cellule e smaltirlo.
11. Preparare una quantità sufficiente di cryovials. Una volta che le cellule sono in contatto con DMSO, dovrebbero essere aliquotati e congelato entro 2-3 minuti.
12. Picchiettare lievemente il tubo, per rimuovere completamente il pellet dal fondo del tubo e risospendere le cellule in A. Medio congelamento [pipettando gentilmente su e giù con un 5-mL sierologici pipetta]. A seguito di sospensione uniforme di grumi, aggiungere uguale volume di B Media congelamento ad esso, in maniera goccia a goccia, mentre rimestando delicatamente la sospensione cellulare per mescolare.
    
    Nota: A questo punto, le cellule sono in contatto con DMSO, e il lavoro deve essere eseguito in modo efficiente. Una volta che le cellule sono in contatto con DMSO, dovrebbero essere aliquotati e congelato entro 2-3 minuti.
13. Aliquota 1 ml di sospensione cellulare in ogni provetta Microbank ™.
14. Introdurre rapidamente le provette in un gelido Mr. [di congelare rapidamente] e trasferirlo a -80 ° C durante la notte.
15. Dopo una notte di stoccaggio a -80 ° C, trasferire le cellule a un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

IPSC disgelo flaconcino e il recupero delle cellule

Nota: KSR-FF può essere sostituito con KSR contenenti MEF condizionata medio, o medio KSR per l'uso con alimentatori. Vedere l'appendice per le istruzioni per la preparazione dei media.

Preriscaldare 10 ml di KSR-FF media in un tubo da 50 ml.

1. Equilibrare la quantità appropriata di Geltrex rivestite piatti a temperatura ambiente ed aspirare il liquido dai piatti poco prima di placcaturar cellule.
2. Rimuovere con cura il hESC (o IPSC) fiala da serbatoio di stoccaggio di azoto liquido.
3. Rapido disgelo fiala congelata di cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C, fino a poco un piccolo pezzo rimane congelato nel flacone.
4. Spray fiala con il 70% di isopropanolo per decontaminare e trasferimento alla cappa sterile coltura di tessuti.
5. Trasferire asetticamente l'intero contenuto del flacone in un tubo da 15 ml con una pipetta da 5 ml.
6. Sciacquare la fiala con 1 ml di KSR-FF e aggiungere questo al tubo da 15 ml per centrifuga.
7. Lentamente, aggiungere 4 ml di KSR-FF goccia a goccia per le cellule nel tubo 15 ml conica. Mentre l'aggiunta del mezzo, spostare delicatamente il tubo avanti e indietro per mescolare le cellule. (Questo riduce shock osmotico alle cellule).
8. Centrifugare il tubo di 15 ml con la sospensione cellulare a 1000rpm (200 x g) per 2 minuti a temperatura ambiente.
9. Con attenzione aspirare e scartare il sopranatante senza disturbare il pellet.
10. Risospendere il pellet di cellule in fase di pre-riscaldato KSR-FF (ad esempio 4mL/60 piatto mm) con una pipetta da 5 ml e pipettare delicatamente le cellule su e giù fino a pellet cellulare è completamente dispersa. Una vitalità maggiore del 70% è previsto, se la vitalità è inferiore al 70%, può richiedere più tempo per le cellule di raggiungere confluenza.
11. Utilizzando la medesima pipetta, trasferire la sospensione cellulare goccia a goccia a Geltrex rivestite piatto cultura pre-equilibrati a temperatura ambiente.
12. Porre la capsula la cultura in un incubatore a 37 ° C, con un atmosfera umidificata da 4 a 6% di CO ₂ in aria. Con attenzione nave vortice in direzione nord a sud, da est a ovest modello per distribuire uniformemente le cellule.
13. Delicatamente liquido cambiare il piatto cultura 24 ore post-disgelo e quindi giornalmente per rimuovere i detriti cellulari e per fornire nutrienti fresco fino a quando il piatto è circa il 70-80% confluenti. Per la cultura continua e passaging delle cellule iPS, fare riferimento al nostro protocollo dal titolo "Alimentazione-Free Cultura e Passaging di cellule umane iPS usando completa sostituzione siero KnockOut alimentatore-Free Media"

Risultati attesi

Le cellule dovrebbero essere circa il 70-80% confluenti prima di crioconservazione. Dispasi risultati digestione nel curling e piegatura delle colonie lungo i margini colonia. Dopo la raccolta le cellule sono congelati come piccoli ammassi in mezzi crioconservazione. Una volta che il flacone è scongelato, le cellule recuperare e allegare alla pre-rivestite piatto come grumi di piccole dimensioni. Crescono rapidamente porta a un piatto confluenti in 5-6 giorni.

Tabella 1 - Volumi consigliati

Componente	35 millimetri Piatto	Piatto 60 millimetri	Dish 100 millimetri
Completa KnockOut SR media	2 ml	4 mL	10 mL
Geltrex Soluzione	1 ml	1,5 ml	4-5 mL
Dispasi	0,5 ml	1 ml	3-4 ml
D-PBS per il risciacquo	2 ml	4 mL	10 mL

Si prega di cliccare qui per vedere l'appendice .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)
KnockOut Serum Replacement		10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg		PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercapt–thanol		21985-023
Dispase		17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium		14190-144
DMSO, 500mL	JT Baker	JT9224-1
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60 mm Tissue Culture treated dishes
Liquid nitrogen storage tank
Isopropanol freezing containers
1.5 mL Cryovials