Summary
Detta dokument beskriver metodiken för att fastställa kemotaxi svar av leukocyter till specifika ligander och identifiera interaktioner mellan receptorer på cellens yta och cytosola proteiner använder levande tekniker cell imaging.
Abstract
G-proteinkopplade receptorer (GPCRs) hör till de sju transmembrana proteinet familj och förmedlar transduktion av extracellulära signaler till intracellulära svar. GPCRs styra olika biologiska funktioner som kemotaxi, intracellulär kalcium release, genreglering i en ligand beroende sätt via heterotrimeric G-proteiner 1-2. Ligandbindande inducerar en serie konformationsanalys förändringar som leder till aktivering av heterotrimeric G-proteiner som modulerar nivåerna av andra budbärare som cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP), inositol trifosfat (IP3) och diacyl glycerol (GD). Samtidig med aktivering av receptorn ligandbindande initierar också en rad evenemang för att dämpa receptor signalering via hyposensibilisering, kvarstad och / eller internationalisering. Den hyposensibilisering process GPCRs sker via receptorn fosforylering av G-protein receptor kinaser (GRKs) och senare bindning av β-arrestins 3. β-arrestins är cytosoliskt proteiner och translocate till membran på GPCR aktivering, bindning till fosforylerat receptorer (oftast) det genom att underlätta receptor internalisering 4-6.
Leukotrien B 4 (LTB 4) är ett pro-inflammatoriska lipid molekyl från arakidonsyra vägen och förmedlar sina åtgärder via GPCRs, LTB 4 receptor 1 (BLT1, en hög affinitet receptor) och LTB 4 receptor 2 (BLT2, en låg affinitet receptor ) 7-9. LTB 4-BLT1 vägen har visat sig vara kritiska i flera inflammatoriska sjukdomar inklusive astma, ledgångsreumatism och åderförkalkning 10-17. Den aktuella artikeln beskriver de metoder som utvecklats för att övervaka LTB 4-inducerad leukocytmigration och växelverkan av BLT1 med β-arrestin och receptor translokation i levande celler med hjälp av tekniker mikroskopi avbildning 18-19.
Benmärg härrör dendritiska celler från C57BL / 6 möss var isolerade och odlade som tidigare beskrivits 20-21. Dessa celler testades i levande metoder cell imaging att visa LTB 4 inducerad cell migration. Den mänskliga BLT1 var märkta med röd fluorescerande protein (BLT1-RFP) vid C-terminus och β-arrestin1 märkta med grönt fluorescerande protein (β-ank-GFP) och transfekterade de båda plasmider i Rat basofila Leukomia (RBL-2H3) cellinjer 18-19. Kinetiken för samspelet mellan dessa proteiner och lokalisering övervakades använder levande mikroskopi cell video. De metoder som i den aktuella papper beskriver användningen av mikroskopiska tekniker för att undersöka den funktionella svar på G-proteinkopplade receptorer i levande celler. Den aktuella artikeln beskriver också användandet av metamorfa programvara för att kvantifiera fluorescens intensitet att bestämma kinetik receptorn och cytosola interaktioner protein.
Protocol
Metodik
Beskrivning av mikroskop
Levande cell imaging experiment utförs med hjälp av TE-FM Epi-Fluorescens-systemet knutna till Nikon inverterat mikroskop Eclipse TE300. Mikroskopet är utrustade med värme scen. En cool kick HQ digital B / W CCD (Roper vetenskapliga) kamera och Lamda 10-2 optiskt filter växlare (Sutter instrument företag) är kopplad till mikroskop. Excitation och emissionsvåglängder styrs med filter hjul och kontrolleras av Lamba 10-2 filterhjul controller bör Sutter Instrument Co Slutartid 500 ms vara tillräckligt för att visa RFP eller GFP i levande celler. Hårdvara kontroll och förvärv av bilder styrs av metamorfa programvara. Valet av filter för den aktuella studien är, ställer filter S480/20x, S525/40m och S565/25x, S620/60m för GFP och RFP, respektive EGFP / DsRed dubbla dikroiskt, Chroma Technology. Detta filter hjul rymmer upp till sex filter set. Mikroskop är fäst med tidigare ProScan steg-styrenhet med Joystick. Alla dessa hårdvara bilagor kan styras av metamorfa programvara. Mikroskopet är också fäst med Micromanipulators att hålla mikropipetter.
A. Mätning Leukotriene B 4 Regi dendritiska celler Migration
Med hjälp av ovan beskrivna mikroskop inställning, vi utvecklat metoder för att följa ligand riktad dendritiska celler migration i realtid. Två micromanipulators (Narishige) länkade till mikroskopet. Den chemotaxis av benmärg från mus härledda dendritiska celler (BMDCs) mot LTB 4 lutning spelades in. Här beskriver vi de metoder för att förbereda mikro-pipetter med en mikro-pipett avdragare, lastning liganden i mikro-pipett och inrätta chemotaxis experiment på den uppvärmda skede av mikroskop för att övervaka riktad migration av celler. Denna metod kan användas för att testa effekten av olika chemoattractants på att nå migration samt effekt av hämmare av kemotaxi i levande celler. Isoleringen av BMDCs 21 från mus har beskrivits i flera publikationer inklusive JUPITER 22.
1. Beredning av BMDCs
- Tavla av BMDCs (efter odling i 10 dagar) på locket glida ner Fluoro skålen och låta dem växa till 16 timmar före experimentet.
- Tvätta cellerna med 3 ml 1X PBS minst 2 gånger (genom att tillsätta 3 ml 1X PBS på plattan och aspirerande bufferten ut).
- Tillsätt 2 ml 1XPBS till tallrik. Cellerna är nu redo för experimentet. Förvara cellerna i 37 ° C inkubator före att experimentera.
Beredning av liganden laddade micro pipett:
- Fäst glaset kapillärrör (Glas standard, 0,75 mm x 0,4 mm, 6 ", Cat # 625.500, AM Systems, Inc) på den vertikala mikropipett avdragare (Narishige International USA, Inc).
- Håll temperaturen på 52 ° C och låt glaset att smälta och dra isär för att bilda vassa kanter tips.
- Fix pipetten på mikro-pipett hållare.
- Jämna ut ojämna kanter av mikro-pipett att använda Micro skapa M-900 (Narishige International USA, Inc) genom att titta i mikroskop.
- Förbered minst 10-20 pipetter för varje experiment. Obs: mikropipetter kan också köpas från instrument World Precision (μ TIP, T1801TW1F).
- Ta önskad koncentration (500 mikroliter 100 nm LTB 4 i det aktuella experimentet) av ligand till 1 ml effendorf tuben och hålla mikro pipettspetsen i lösningen och låt lösningen gå in i mikro pipett (återfyllning).
- Ta 1 ml ligand och i sprutan (1 cc tuberkulin spruta) och långsamt fyller ligand med en mikro-Fill nål (MF 28G-5, World precisionsinstrument) i mikro pipetten uppifrån.
- Fäst slangen, som passar tätt mot pipetten på pipett och rör till st (21 G 11 / 2) bifogas till 1 ml spruta, som är fylld med ligand.
- Nu, försiktigt flytta ligand fylld mikro-pipett till mikroskop scenen och fixa på mikro manipulatorer.
- Applicera lite tryck från sprutan för att se ligand långsamt släpper från spetsen.
- Ta med pläterade omogna BMDCs till mikroskop och hålla dem på den uppvärmda plattan (37 ° C) stadium.
- Ta av locket på fluor maträtt.
- Fokusera celler med hjälp oljeimmersion 60X objektiv.
- Försiktigt, få ner liganden laddas pipetten med "Grov Manuell Manipulator MN-188NE" till närheten av cellerna.
- Fokusera pipetten med hjälp av "Hydraulisk Fin mikromanipulator MN-188 NE".
- Applicera lite tryck från sprutan för att säkerställa att ligand släpper in i skålen.
- Ställ in parametrarna bilden förvärvet att förvärva i ljusa in (10 ms exponering) i varje 15 sek för 2 timmar med hjälp av metamorfa programvara.
- Håll uppföljning var 30 min för PRogression migration mot ligand.
- Om cellerna är trångt på pipettspetsen, ändra platsen för spetsen i plattan för att fortsätta migration av experimentet.
B. Mätning GPCR (BLT1) och cytosolproteinet (β-arrestin) interaktioner, translokation hos levande celler
1. Beredning av Plasmid DNA Konstruerar
Detaljerna i DNA-plasmid konstruktioner beskrevs i Jala et al. (2005) 18.
2. Transfektion mänskliga BLT1-RFP och β-Arrestin-GFP till RBL-2H3 celler
- Bibehåll Rat basofila Leukomia (RBL-2H3) celler (60 till 70% sammanflödet) vid 37 ° C i en fuktig atmosfär av 95% luft, 5% CO 2 som monolayer kulturer i tillväxt media (DMEM kompletteras med 15% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 mikrogram / ml streptomycin) i T75 kolvar.
- Lossa celler från skålen / flaskor med hjälp av 6 ml trypsin-EDTA (0,05% trypsin, 0,53 mM EDTA) och inkubera i 5 minuter vid 37 ° C i en fuktig atmosfär av 95% luft, 5% CO 2. Skaka försiktigt flaskor för att övervaka omfattningen av att cellerna lossnar.
- Tillsätt 6 ml tillväxt media till kolv som innehåller 6 ml Trypsin-EDTA och samla in de celler genom att blanda dem genom att pipettera upp och ned flera gånger. Överför celler till 15 ml Falcon rör.
- Räkna celler med hjälp av en hemocytometer och ta 4 x 10 6 celler i 15 tuber mL centrifugrör och centrifugera vid 480g rpm i 3 min och återsuspendera i 200 mikroliter av transfektion medier (DMEM, 20% FBS, 50 mm HEPES). Om du planerar att utföra 3 transfections, förbereda cellerna och media tranfection detta genom att öka mobilnummer och volymen av transfektion medium.
- Förbered plasmider som ska transfekterade vid koncentrationer på minst 1,5 mikrogram / mikroliter. Vi förbereder DNA plasmid med QIAGEN Maxi DNA plasmid kit. Lägg till den enskilde eller både plasmid DNA som kodar för humant BLT1-RFP (25 mikrogram) och β-arrestin1-GFP (15 mikrogram) till sterila elektrofores kyvetter, (Bio-Rad # 16.552.088), som har 0,4 klyftan cm elektrod.
- Ta 200 mikroliter av ovanstående återsuspenderade cellerna och placera dem i kyvetter med antingen hBLT1-RFP eller β-arrestin1-GFP eller båda tillsammans och blanda dem försiktigt med 1 mL steril pipett.
- Lämna över kyvetter i rumstemperatur i 10 min.
- Electroporate cellerna i Gene Pulser II med spänning 250 V och kapaciteten 500 uF.
- Efter elektroporation låt cellerna hålla i rumstemperatur i 10 min.
- Ta 1 ml av regelbunden tillväxt medium och blanda det med electroporated celler i kyvetter.
- Fördela 300 mikroliter av denna blandning i 35 glas mm vävnad botten kultur rätter (Fluoro maträtt, World precisionsinstrument) innehållande 2 ml regelbunden tillväxt media och inkubera i 1 timme vid 37 ° C i en fuktig atmosfär av 95% luft, 5% CO 2. Låt cellerna att ansluta sig till botten av skålen.
- Byt ut media efter 1 h inkubation med regelbunden tillväxt medier och låta dem växa vid 37 ° C i en fuktig atmosfär av 95% luft och 5% CO 2 inkubator för 18-24 timmar.
3. Levande cell imaging
Förvärv av bilder
- Efter 18-24 timmar, tvätta cellerna 2 eller 3 gånger med 2 ml varmt fenolrött gratis RPMI innehållande 10 mM HEPES, pH 7,55 (Tillsätt 2 ml varmt media direkt på plattan och aspirera medier. Upprepa 2 eller 3 gånger). Tillsätt 1,8 ml varmt fenolrött gratis RPMI innehållande 10 mM HEPES.
- Placera 30 mm glas täckglas botten kultur rätter som innehåller RBL-2H3 celler transfekterade med hBLT1-RFP och β-arrestin1-GFP på det uppvärmda mikroskop scenen (37 ° C).
- Samla cellen bilder med 600x förstoring med 60 X-objektiv Nikon Plan Apo 60X/1.4 numerisk bländare oljeimmersion objektiv (finns i våra mikroskop system).
- Sätt en olja droppe på 60 x objektiv lins och fokus cellerna med jämna ljusa fält ljus genom att vidröra botten av plattan.
- För att övervaka fluorescens transfekterade proteiner, växla från ljust fält (ljus) till fluorescens filter (RFP filter om du vill se receptorn eller GFP, om du vill se β-arrestin1).
- Välj ljusa och friska celler, som uttrycker hBLT1-RFP på cellens yta med hjälp av RFP filter och ta bilden.
- Sedan övergången till GFP filtret och se till att β-arrestin-GFP uttryckt i cytoplasman och ta bilden. Sedan pseudo färg både på bilderna, innan du tar tid förfallit levande cell bilder för att se till att blöda igenom av fluorescens inte tar inträffar mellan RFP och GFP.
- När valet av din cell gjorts, ställa in parametrarna enligt ditt syfte med hjälp av programvara (metamorfa Software i detta fall).
- I den aktuella demonstrationen, är sexton bitars bilder anskaffats med komra binning satt till 1 X 1 i kombination med 60 X-objektiv Nikon Plan Apo 60X/1.4 numerisk bländare oljeimmersion lins.
- Samla fluorescens bilder för RFP och GFP fluorokromer samtidigt vid 30 sek intervall (om translokation / interaktioner är för snabbt, kan man minska tiden intervall) av dessa använder filter hjul som styrs av metamorfa programvara.
- Exponeringen gånger satt till 1000 msek för RFP och GFP. (Ställ in på de särskilda tider enligt den fluorescerande intensitet RFP och GFP).
- Först samla bilder för 1 minut utan att lägga till ligand, som tjänar som 0 tidpunkt.
- Tillsätt 200 mikroliter av ligand (från lager av 10 mikroM till en slutlig koncentration av 1 M) efter 1 minut utan att störa platta / eller celler position.
- Fluorescensen bilderna samlas i 60 min efter att ha lagt liganden och lagras som TIFF-bilder med ökande ordning på filnamnen.
- Alla dessa filer kan göras så stack filer med enskilda / kombinerade fluorescens bilder med tidsstämplar med programvaran.
Process av bilder och kvantifiering av fluorescens av proteiner och lokalisering
- Förvärva bilder med vanlig media (inga celler) med RFP och GFP fluorescerande filter och spara dem som bakgrundsbilder. Använd dessa bilder för att subtrahera från faktiska uppgifter bilder som erhållits ovan.
- Förbered bunt bilder individuellt för RFP och GFP bilder.
- Välj / definiera de olika regionerna (yta vs cytosoliskt) för att mäta fluorescens intensiteten i RFP och GFP (BLT1 och β-arrestin translokation)
- Plotta de stödnivåer beloppet fluorescens som funktion av tiden. Detta diagram kommer att ge information om kinetiken av flyttning av viss molekyl.
Representativa resultat
A. Mätning Leukotriene B 4 Regi dendritiska celler Migration
Den metod som beskrivs i detta protokoll har använts för att bestämma dendritiska celler rör sig mot leukotrien B 4 (Figur 1 och bifogade video 1) 21. Vi kan tillämpa liknande metoder för att bestämma kemotaxi förmåga celler till en viss ligand i levande celler.
Figur 1. Benmärg från mus härledda dendritiska celler rör sig mot 100 nM LTB 4.
Video 1. Levande cell migration av BMDCs mot LTB 4. Klicka här för att se videon .
B. Mätning GPCR (BLT1) och cytosolproteinet (β-arrestin) interaktioner, translokation hos levande celler
Efter avslutad detta förfarande kan man få följande information i GPCR signalering händelser.
- Lokalisering av GPCR och cytosola proteiner och kärnan (Figur 2).
- Ligand inducerad samspelet mellan yta GPCR (BLT1 i detta fall) med cytosolproteinet (β-arrestin i detta fall) (Fig. 3).
- Kinetiken av receptor internalisering och β-arrestin translokationen till membran följt av internalisering tillsammans med receptorer (Figur 4) (Jala et al. 2005) 18.
- Man kan bestämma liganden beroendeställning aktivering av receptorn i levande celler (bifogas video 2) och fastställa kritiska motiv eller processer är involverade i aktivering av receptorn (Jala et al. 2005) 18.
Figur 2. Redovisning av BLT1-RFP (A), β-arrestin-GFP (B), pNuc-fiskeripolitiken (C) till RBL-2H3 celler. Färg kombination bilden som visas i panelen D.
Figur 3. Ligand inducerad flyttning av receptorn och β-arrestin. Linje genomsökning av fluorescerande intensitet i cellerna visas.
Figur 4. Kinetik receptor internalisering och β-arrestin translokation efter tillägg av 1 mikroM LTB 4. Fluorescensen intensiteter mättes som en funktion av tid på membran och cytosola platser i cellen.
Video 2 Live avbildning av celler som uttrycker BLT1-RFP och β-arrestin-GFP efter tillägg av 1 mikroM LTB 4. Klicka här för att se på video
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levande cell imaging är ett kraftfullt verktyg för att demonstrera funktionen och interaktioner av specifika proteiner när de inträffar i realtid. De metoder som beskrivs i detta manuskript visar tydligt att LTB 4 kan inducera en snabb migration av dendritiska celler. Dessa metoder inte bara bygga ut delar av LTB 4 funktion till olika celltyper, de tillåter liknande metoder som skall tillämpas på en mängd andra kemokiner och testa deras effektivitet som kemotaxi agenter på olika leukocyt sub populationer. Fluorescens avbildning i detta system gör det möjligt för övervakning av signalering händelser i realtid. Dessutom kan dessa metoder även utvidgas till att undersöka de snäva sammanslutning av molekyler in vivo genom att följa fluorescens överföra resonans energi (FRET) med hjälp av lämpliga flurochromes taggade molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Forskningen stöds av National Institutes of Health bidrag AI-52.381, CA138623 och Kentucky Lung Cancer Research Board och institutionellt stöd från James Graham Brown Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells. | ATCC | CRL-2256 | |
| Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Phenol red free RPMI or DMEM | Invitrogen | 11835-030 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300 | |
| HEPES (1M) | Invitrogen | 15630 | |
| 35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | |
| Gene Pulser II electroporater | Bio-Rad | ||
| TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 | Nikon Instruments | ||
| Metamorph Software | Universal Imaging | ||
| Vertical Micro-pipette puller | Narishige International | ||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | ||
| Hadraulic Micromanipulator MO-188NE | Narishige International | ||
| Coarse Manual Manipulator, MN-188NE | Narishige International | ||
| cDNA constructs: | |||
| cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP) | Jala et al 2005 | ||
| cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study). | Jala et al 2005 |
References
- Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
- Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors. Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J.
- Lefkowitz, R. J. G. protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization. J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).
- Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling. Biochem J. 375, 503-515 (2003).
- Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines. Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).
- Tager, A. M., Luster, A. D. BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).
- Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T.
- Haribabu, B. Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis. J Exp Med. 192, 433-438 (2000).
- Subbarao, K. Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators. Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).
- Heller, E. A. Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment. Circulation. 112, 578-586 (2005).
- Miyahara, N. Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).
- Terawaki, K. Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses. J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).
- Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice. J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J Exp Med. 203, 829-835 (2006).
- Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors. J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells. Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).
- Del Prete, A., A, Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function. Blood. 109, 626-631 (2007).
- Salogni, L. Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14. Blood. 113, 5848-5856 (2009).
- Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J Vis Exp. , (2008).
