Summary
الأغشية الحيوية تشكلت على أسطح الأسنان معقدة للغاية وتتعرض للتحديات البيئية المستمرة الفطرية والخارجية ، والتي تعدل من الهندسة المعمارية ، والفيزيولوجيا وtranscriptome. قمنا بتطوير مجموعة أدوات لفحص تكوين وتنظيم هيكلية والتعبير الجيني من الأغشية الحيوية عن طريق الفم ، والتي يمكن تكييفها لمناطق أخرى من البحوث بيوفيلم.
Abstract
الأغشية الحيوية والديناميكية العالية ومجتمعات منظمة ومهيكلة من الخلايا الميكروبية المنغمسين في المصفوفة خارج الخلية من كثافة وتكوين متغير 1 ، 2. عموما ، تطوير الأغشية الحيوية الجرثومية الأولية من التعلق على سطح يليه تشكيل مجموعات خلايا (أو microcolonies) ومزيد من التنمية والاستقرار في microcolonies ، والتي تحدث في المصفوفة خارج الخلية المعقدة. غالبية exopolysaccharides بيوفيلم الميناء مصفوفات (EPS) ، والأغشية الحيوية الأسنان ليست استثناء ، خصوصا تلك المرتبطة بمرض تسوس ، والتي هي في الغالب التي توسطت العقديات الطافرة 3. وقد تم تجميع السهم من قبل الكائنات الحية الدقيقة (الطافرة S. ، مساهما رئيسيا) عن طريق الانزيمات خارج الخلية ، مثل السكروز glucosyltransferases به في المقام الأول باعتباره الركيزة 3.
دراسات الأغشية الحيوية تشكلت على أسطح الأسنان وتحديا من نوع خاص نظرا لتعرضهم المستمر لمواجهة التحديات البيئية المرتبطة بالنظام الغذائي التفاعلات المضيف الجرثومية المعقدة التي تحدث في تجويف الفم. وفهم أفضل للتغيرات دينامية التنظيم الهيكلي وتكوين مصفوفة ، والفيزيولوجيا وtranscriptome / ملف بروتيوم بيوفيلم من خلايا استجابة لهذه التفاعلات المعقدة المزيد من التقدم في المعرفة الحالية لكيفية الأغشية الحيوية عن طريق الفم تعدل المرضية. ولذلك ، قمنا بتطوير أداة تحليلية علبة لتسهيل التحليل بيوفيلم المستويات الهيكلية ، والكيمياء الحيوية والجزيئية من خلال الجمع بين التقنيات المتاحة عموما والرواية مع العرف صنع البرمجيات لتحليل البيانات. وتم دمج القياسية التحليلية (المقايسات اللونية ، RT qPCR وميكروأرس) وتقنيات مضان رواية (لوصفها في وقت واحد من البكتيريا وEPS) مع برامج معينة لتحليل البيانات للتعامل مع الطبيعة المعقدة للبحوث بيوفيلم عن طريق الفم.
وتتألف الأداة علبة من 4 خطوات متميزة ولكنها مترابطة (الشكل 1) : 1) اختبارات بيولوجية ، 2) إدخال البيانات الخام ، 3) معالجة البيانات ، و 4) تحليل البيانات. كنا في المختبر لدينا نموذج بيوفيلم والظروف التجريبية المحددة للتدليل على فائدة ومرونة من مربع الأدوات. ويمكن القيام بيوفيلم نموذج بسيط ، واستنساخه عدة نسخ متماثلة من تجربة واحدة في وقت واحد 4 ، 5. وعلاوة على ذلك ، فإنه يسمح تقييم الزمانية ، وإدراج مختلف أنواع الجراثيم (5) وتقييم الآثار المترتبة على ظروف تجريبية مختلفة (مثل العلاجات 6 ؛ مقارنة بالضربة القاضية مقابل المسوخ سلالة الأبوية 5 ؛ توافر الكربوهيدرات 7). هنا ، نحن تصف عنصرين محددة من مربع الأدوات ، بما في ذلك (ط) برامج جديدة لاستخراج البيانات ميكروأري / المنظمة (المالديف) ، وتحليل التصوير مضان (DUOSTAT) ، و (الثاني) في الموقع EPS وضع العلامات ونحن نقدم أيضا حالة تجريبية توضح كيفية الأداة علبة يمكن أن تساعد في تحليل الأغشية الحيوية ، وبيانات المنظمة ، والتكامل والتفسير.
Protocol
1. الخطوة 1 -- اختبارات بيولوجية
الأسلوب بيوفيلم يستخدم أقراص من هيدروكسيباتيت (HA) ومركب الأسنان (كلاركسون اللوني المنتجات المحدودة ، جنوب يليامزبورت ، والسلطة الفلسطينية ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ المساحة = 2.7 ± 0.2 سم 2) المغلفة مع اللعاب (محاكاة وجود جليدة المكتسبة) ، وضعت في وضع عمودي 4 ، 5 ، 8.
- فحوصات البيوكيميائية.
- والأغشية الحيوية هي إما (ط) من قبل المتجانس صوتنة 9 أو (ب) الحفاظ عليه للفحوصات البيوكيميائية 8. يمكن استخدام الأغشية الحيوية تعليق المتجانس لتحديد الكتلة الحيوية (الوزن الجاف) والبروتين وغير العضوية الكاملة ، وخارج الخلية داخل الخلايا والسكريات. تكوين / المحتوى (انظر التفاصيل في ليموس وآخرون ، بروتوكولات لدراسة فسيولوجيا الأغشية الحيوية عن طريق الفم 8) ويمكن تحليلها في الأغشية الحيوية سليمة على ردودهم الفسيولوجية باستخدام معيار الحموضة الإفلات حال السكر ، وحامض لقتل نفاذية بروتون ، والمقايسات النشاط F - أتباز (انظر التفاصيل في ليموس وآخرون ، بروتوكولات دراسة فسيولوجيا الأغشية الحيوية عن طريق الفم 8).
- تحليلات Transcriptome.
- ويمكن استخدام معيار [كدنا] [ميكروأري وRT - qPCR البروتوكولات (على سبيل المثال http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html) في تركيبة لتحديد الاستجابة لمسببات الأمراض transcriptome محددة (مثل الطافرة S.) داخل الأغشية الحيوية لمختلف التحديات البيئية والعلاجية في مختلف مراحل النمو 6 ، 7 ، 10 ، 11. في مربع الأدوات ، أدرجنا طريقتين التي تعتبر بالغة الأهمية لتحليل transcriptome الأغشية الحيوية من الأسنان : 1) RNA الجودة (بسبب الطبيعة غير المتجانسة للسكان بيوفيلم وجود EPS - المصفوفة) ، و 2) استخراج البيانات وتفسيرها (بسبب مجموعة كبيرة من البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة ميكروأري).
- RNA العزلة. ولمعالجة هذه المسألة نوعية الحمض النووي الريبي المستخرج من الأغشية الحيوية ، ونحن نستخدم بروتوكول الأمثل وضعت خصيصا لعزل الحمض النووي الريبي وتنقيتها من الخلايا البكتيرية في شرك EPS الغنية مصفوفة 12 (http://dx.doi.org/10.1016/j . ab.2007.03.021). يوفر هذا البروتوكول رقم النزاهة RNA (رين) أعلى من 8.5 ، والتي تعتبر مثالية للتحليل باستخدام كل transcriptome RT - qPCR وميكروأرس] (للحصول على أمثلة ، انظر 6 ، 11).
- ويمكن استخدام معيار [كدنا] [ميكروأري وRT - qPCR البروتوكولات (على سبيل المثال http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html) في تركيبة لتحديد الاستجابة لمسببات الأمراض transcriptome محددة (مثل الطافرة S.) داخل الأغشية الحيوية لمختلف التحديات البيئية والعلاجية في مختلف مراحل النمو 6 ، 7 ، 10 ، 11. في مربع الأدوات ، أدرجنا طريقتين التي تعتبر بالغة الأهمية لتحليل transcriptome الأغشية الحيوية من الأسنان : 1) RNA الجودة (بسبب الطبيعة غير المتجانسة للسكان بيوفيلم وجود EPS - المصفوفة) ، و 2) استخراج البيانات وتفسيرها (بسبب مجموعة كبيرة من البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة ميكروأري).
- مضان التصوير. هيكلية تنظيم الأغشية الحيوية.
- معظم بروتوكولات التصوير مضان مبائر المتاحة في أدبيات يركز على وضع العلامات الميكروبية. وقد تم تحليل EPS باعتبارها عنصرا رئيسيا من بيوفيلم مهملة الى حد كبير في البحوث بيوفيلم الشفوية التي تشمل التصوير مضان ، مع استثناءات قليلة 5 ، 13 ، 14. قمنا بتطوير تقنية جديدة ووضع العلامات برامج معينة لرؤية استنساخه وتقدير حجم العائد على السهم والخلايا البكتيرية في وقت واحد داخل الأغشية الحيوية سليمة. يستخدم أميرة 5 (سيماء التصوير محدودة ، برلين ، ألمانيا) لإعادة الإعمار 3D من الأغشية الحيوية ، في حين COMSTAT (متوفر في http://www.imageanalysis.dk) وDUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk) تقديم التحليل الكمي.
- التصوير التنظيم الهيكلي للبكتيريا EPS في الأغشية الحيوية. يستخدم فلور اليكسا 647 المسمى ديكستران المتقارن لتصور EPS - مصفوفة. لديكستران الفلورسنت ذات العلامات بمثابة التمهيدي للالعقديات glucosyltransferases - Gtfs (GtfB خاصة وGtfC) ، ويمكن إدراجها في وقت واحد خلال عملية التوليف exopolysaccharide مصفوفة على مسار التنمية بيوفيلم 11.
EPS العلامات :- أقراص هيدروكسيباتيت معطف مع اللعاب فلتر لتعقيم 1H ، في أعقاب "إعداد بيوفيلم" بروتوكول 8.
- ماصة 2.8 مل من المتوسط الثقافة في كل بئر من 24 لوحات جيدا ، وتقديمهم إلى غرفة مظلمة.
- إضافة 1 ميكرومتر من اليكسا ديكستران فلور مترافق في مستنبت ، مزيج صبغة في مستنبت بواسطة pipetting صعودا وهبوطا (حوالي 10 مرات).
- تراجع غسل لعاب المغلفة HA (SHA) أقراص (بعد حضانة ح 1) مرتين في المخزن AB العقيمة ووضعها في المتوسط تحتوي على ديكستران مترافق اليكسا فلور.
- تغطية لوحة بورق الألمنيوم واحتضان عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. مدة حضانة المرض من الوقت يعتمد على تصميم كل التجريبية. لديكستران fluorescently المسمى لا وصمة عار على الخلايا البكتيرية بتركيزات المستخدمة في هذا النحوويقول 11. أخرى EPS تلطيخ التقنيات ، مثل مع Calcofluor 14 ، يمكن استخدامها في الجمع.
- البكتيريا العلامات :
- وصفت مكونات البكتيريا في الأغشية الحيوية في نهاية تشكيل بيوفيلم باستخدام معيار الحمض النووي الفلورسنت وصمة عار (مثل SYTO 9) ، ويمكن مضان تقنيات أخرى (مثل أنواع معينة الفلورسنت ذات العلامات الأضداد GFP - 15 أو 16 معربا عن الخلايا) يمكن بالطبع استخدامها ل الكشف عن واحد أو أكثر من الأنواع البكتيرية في الأغشية الحيوية. ويبين الشكل 2 الوسم في وقت واحد EPS (الحمراء) ، والبكتيريا / microcolonies (الخضراء) في صورة 3D من العمر 24 س ح الطافرة بيوفيلم شكلت على سطح قرص SHA.
- اقتناء الصور : يتم فحص كل بيوفيلم في 5-10 مواقع مختارة عشوائيا ، ويتم إنشاؤها بواسطة سلسلة ض sectioning البصرية في كل من هذه المواقف التي ليزر متحد البؤر المسح المجهري باستخدام البروتوكولات القياسية. نستخدم FV أوليمبوس 1000 اثنين الفوتون المجهر (أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان) مجهزة X10 (كارل زايس ؛ الفتحة العددية 0.45 ، والعمل ملم مسافة 3-4) أو X25 (أوليمبوس LPlan N ؛ NA 1.05 ؛ WD 2 مم) المياه الغمر الأهداف. طول الموجة 810 نانومتر والإثارة ، وانبعاث موجة تصفية SYTO 9 (البكتيريا) هو 495/540 OlyMPFC1 التصفية ، في حين أن تصفية فلور اليكسا 647 (EPS) هو HQ655/40M-2P التصفية. حفظ وتخزين الصور الخام.
- التصوير التنظيم الهيكلي للبكتيريا EPS في الأغشية الحيوية. يستخدم فلور اليكسا 647 المسمى ديكستران المتقارن لتصور EPS - مصفوفة. لديكستران الفلورسنت ذات العلامات بمثابة التمهيدي للالعقديات glucosyltransferases - Gtfs (GtfB خاصة وGtfC) ، ويمكن إدراجها في وقت واحد خلال عملية التوليف exopolysaccharide مصفوفة على مسار التنمية بيوفيلم 11.
- معظم بروتوكولات التصوير مضان مبائر المتاحة في أدبيات يركز على وضع العلامات الميكروبية. وقد تم تحليل EPS باعتبارها عنصرا رئيسيا من بيوفيلم مهملة الى حد كبير في البحوث بيوفيلم الشفوية التي تشمل التصوير مضان ، مع استثناءات قليلة 5 ، 13 ، 14. قمنا بتطوير تقنية جديدة ووضع العلامات برامج معينة لرؤية استنساخه وتقدير حجم العائد على السهم والخلايا البكتيرية في وقت واحد داخل الأغشية الحيوية سليمة. يستخدم أميرة 5 (سيماء التصوير محدودة ، برلين ، ألمانيا) لإعادة الإعمار 3D من الأغشية الحيوية ، في حين COMSTAT (متوفر في http://www.imageanalysis.dk) وDUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk) تقديم التحليل الكمي.
2. الخطوة 2 -- RAW DATA INPUT
إدخال البيانات الخام من فحوصات البيوكيميائية وRT - qPCR مباشرة في ملف بيانات أولية (RDF - MS ملف Excel). للبيانات ميكروأرس ، تحميل الصور على قناة واحدة من الشرائح الممسوحة ضوئيا إلى Spotfinder JCVI (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics.html) أو برامج مماثلة. إنشاء شبكة بقعة وفقا لمواصفات JCVI ثم يدويا ضبط لتناسب جميع المواقع داخل الشبكة. قياس قيم كثافة كل بقعة وحفظ في ". MEV" الملفات وتخزينها في "بيانات ميكروأري الخام".
3. الخطوة 3 -- تجهيز البيانات
تنظيم البيانات الخام (البيوكيميائية وRT qPCR) في RDF للتحليل الإحصائي. نقلها إلى "ملف البيانات التي تتم معالجتها" (DPF -- MS ملف Excel). لتحليل التصوير ميكروأري ومضان ، تستخدم برامج معينة (المتاحة حاليا والتي هي من صنع مخصص) لمعالجة البيانات.
- البيانات ميكروأري :
- تقديم البيانات الأولية تم إنشاؤها في الخطوة 2 (المخزنة في "البيانات الخام ميكروأرس]") لخطوة تطبيع البيانات باستخدام برامج معينة. تطبيع البيانات باستخدام تحليل البيانات ميكروأري JCVI البرمجيات ميداس (http://www.tm4.org/midas.html). استخدام LOWESS ومعيار الانحراف تسوية مع الإعدادات الافتراضية ، ثم تحليل تكرار داخل الشريحة. تخزين الملفات التي تحتوي على البيانات تطبيع. في هذه المرحلة (الخام وملفات البيانات وملفات البيانات جاهزة تطبيع) ، وإيداع البيانات ميكروأري في قاعدة بيانات وصول الجمهور (على سبيل المثال التعبير الجيني NCBI الجامع (GEO) في قاعدة بيانات http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) وسجل عدد انضمام لتكون مرجعا في المستقبل.
- مضان بيانات التصوير
- بيوفيلم الهيكل الكمي.
- يتم حساب البيانات الكمية المقابلة لكل عنصر من عناصر الهيكلية (EPS والبكتيريا) من الأغشية الحيوية التي COMSTAT DUOSTAT وضعت حديثا ، والتي كانت كما هو مكتوب في السيناريو MATLAB 5.1. يتم تحميل الصور الخام مضان في مجال البرمجيات وتحليلها على النحو التالي :
- استخدام COMSTAT لحساب الكتلة الحيوية ، والسمك ، وتوزيع طبقة وغيرها من المعالم التي تميز وتحديد هيكل ثلاثي الأبعاد من الأغشية الحيوية (راجع كتيب في http://www.imageanalysis.dk).
- استخدام DUOSTAT لحساب المشترك توطين مكونات بيوفيلم اثنين ، مثل EPS والبكتيريا (الجراثيم أو الأنواع المختلفة و / أو مكونات خارج الخلية) :
- إعداد مسار DUOSTAT في MATLAB 5.1 ، والمجلدات صورة مفتوحة والتي تشمل صورا لعناصر بيوفيلم اثنين.
- اختيار قنوات اللذين ستمتزج وتحليلها. يجب أن يكون لهما صورة المداخن أيضا أحجام بكسل متطابقة في جميع الأبعاد الثلاثة (س ، ص ، ض) ، ونفس العدد من الصور في كل المكدس.
- إعداد عتبات كل قناة وفقا للرجلUAL من COMSTAT. اتبع التعليمات الموجودة في البرنامج واجهة العملية (انظر المادة الفيديو ؛ دليل DUOSTAT في http://www.imageanalysis.dk). إدخال البيانات التي تم الحصول عليها في DPF. انظر المثال في الشكل 4.4.
- ثلاثي الأبعاد الأغشية الحيوية إعادة الإعمار.
- هو تصور بنية ثلاثية الأبعاد من الأغشية الحيوية باستخدام أميرة. استيراد الصور المخزنة في مضان "مجلد الصور الخام" في صناعة البرمجيات ، واستخدام voltex و ISO سطح تقديم لإنشاء 3 - D الاداءات كل من المكونات الموجودة في الأغشية الحيوية (انظر أميرة دليل على http://www.amira.com / الوثائق / الأدلة واطلاق سراح - notes.html). انظر المثال في الشكل 4.4.
- يتم حساب البيانات الكمية المقابلة لكل عنصر من عناصر الهيكلية (EPS والبكتيريا) من الأغشية الحيوية التي COMSTAT DUOSTAT وضعت حديثا ، والتي كانت كما هو مكتوب في السيناريو MATLAB 5.1. يتم تحميل الصور الخام مضان في مجال البرمجيات وتحليلها على النحو التالي :
- بيوفيلم الهيكل الكمي.
4. الخطوة 4 -- تحليل البيانات
البيانات الكمية من البيوكيميائية ، RT - qPCR والمقايسات COMSTAT - DUOSTAT في DPF مستعدون للتحليل الإحصائي. بعد إجراء التحليل الإحصائي ، يمكن بناؤها الرسوم البيانية و / أو الجداول (انظر "نتائج الممثل" المقطع).
1. ميكروأري بيانات المنظمة باستخدام البرمجيات ميكروأري البيانات متخيل (المالديف).
صممنا نظرا لتعقيد والإخراج من مجموعات البيانات الكبيرة عند استخدام ظروف تجريبية ميكروأرس ومتعددة ، وهو برنامج التعدين وتنظيم البيانات يدعى البيانات ميكروأري متخيل (المالديف) 7 (متوفر في http://www.oralgen.lanl.gov/) .
بعد إجراء التحليل الإحصائي باستخدام BRB - ArrayTools (http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) مع قطع من قيمة ف 0.001 للتنبؤ للمقارنة والطبقة الطبقة ، ويمكن تقديم البيانات التي تم إنشاؤها لMDV ، على النحو التالي :
- باستخدام Excel ، تحويل البيانات إلى ملفات BRB MDV النص المفصول. إزالة كافة الرسائل التي تأتي مع عدد الجينات الحالة رقم العلامة ، على سبيل المثال : SMU.1423c ، حذف حرف "ج".
- فتح المالديف. انتقل إلى ملف ، وحدد "حدد المصدر الشرح". اختيار "ملف مسطح". عندما قدم مع مربع الحوار ، واستخدام أزرار استعراض لاختيار الملفات التي تحتوي على شرح لاسم الجين ، أنتولوجيا الجينات (GO) العدد ، الممر ، وبيانات التصنيف الوظيفي.
- انتقل إلى ملف ، واستيراد كل الملفات من البند (1). كل من الملفات يمثل الظروف التجريبية للتحليل. إذا كانت هناك شروط متعددة للتحليل ، على سبيل المثال اثنين من العلاجات مميزة (العلاج 1 و 2) والسيطرة (مركبة) انتقل إلى البند 4.
- في هذه الحالة ، فإن المقارنات الممكنة هي : (أ) تحديد العلاج مقابل 1 (أعرب عن الجينات بشكل مختلف بسبب المعاملة 1) ، (B) 2 العلاج مقابل سيطرة ، و (ج) العلاج العلاج مقابل 1 2. اعتمادا على فرضية عمل ، يمكن تحديد مجموعة مختلفة من الجينات.
- تحديد جينات فقط أعرب تفاضلي في المقارنة ألف (الجينات الفريدة تتأثر العلاج 1) في هذه الحالة ، استخدم الدالة طرح مجموعة من وظائف القائمة. طرح جينات من المقارنة من ألف باء ، وحفظ النتيجة. ثم طرح C من البيانات الناتجة عن ذلك. ويمكن أن يتم نفس الإجراءات للحصول فقط في الجينات ب (الجينات الفريدة تتأثر العلاج 2 فقط).
- فقط لتحديد الجينات المكتشفة في كل من A و B ، استخدم الدالة الاتحاد من ضبط وظائف القائمة على الجمع بين نتائج المقارنات لألف وباء ، وحفظ النتيجة. ثم طرح C من البيانات نتيجة.
- يمكن لهذه الإجراءات يمكن تصور استخدام الرسم البياني فين ، وظهرت في المالديف ، والتي هي أكثر بديهية ، ويسهل فرضية يحركها بيانات المنظمة. سيتم عرض بيانات الناتج فين مخطط في الشاشة (انظر عرض الشاشة في الشكل رقم 3 والمادة الفيديو).
- لحفظ البيانات إلى ملفات نصية المفصول ، انتقل إلى ملف واختر تصدير.
- تصدير ملفات نصية المفصول. فتحها باستخدام إكسل ، وتنظيم إخراج البيانات من MDV في الجداول و / أو سرية لعرض رسومية (انظر الأرقام 4.2 ، 4.3 ، والمادة الفيديو).
5. الممثل النتائج
هنا نقدم مثالا لكيفية عمل أداة تحليلية علبة يدمج مختلف المقايسات دراسة بيوفيلم مع متغيرات متعددة والظروف التجريبية.
الحالة التجريبية :
ديناميات العقدية الطافرة transcriptome ردا على النشا والسكروز أثناء تطوير بيوفيلم 7.
الخلفية :
يمكن للتفاعلات الغذائية النشا والسكروز مع المضيف الأميليز اللعابية وglucosyltransferases العقديات تعزيز تشكيل والفوعة س. الطافرة داخل الأغشية الحيوية التي increasing exopolysaccharides التوليف ، استقلاب السكر وacidogenicity 11. هذا المجمع قد المضيف الممرض - حمية التفاعل تعدل تشكيل الأغشية الحيوية المتصلة بالأمراض المسببة للأمراض تسوس الأسنان. أجرينا تحليلا شاملا والبيوكيميائية transcriptomic (بما في ذلك التنميط الجيني بأكمله) إلى زيادة فهم كيفية S. الطافرة يستجيب لالنشا والسكروز في مراحل مختلفة من التنمية بيوفيلم في حضور الأميليز 7.
تم استخدام أداة تحليلية علبة لمساعدتنا في دمج فحوصات الكيمياء الحيوية والجزيئية من الأغشية الحيوية تشكلت تحت ظروف تجريبية مختلفة ونقاط الوقت. يتم تقديم بيانات الناتج الإجمالي باستخدام أداة تحليلية علبة بطريقة بالتسلسل في الشكل 4 (4،1-4،4). من الجدير بالذكر أن التركيز الرئيسي هنا هو إثبات فائدة من مربع الأدوات بدلا من تفسير البيانات والمناقشة.
- الجمع بين فحوصات البيوكيميائية وRT - qPCR لتحديد الظروف التجريبية لتحليل ميكروأرس أخرى. في البداية ، نحن اختبار 6 السكروز متميزة ومختلفة ، والنشا 5 مجموعات السكروز لتحديد التركيزات المثلى من الكربوهيدرات من أجل التنمية التي الأغشية الحيوية س. الطافرة باستخدام نموذج لدينا في المختبر. القدرة على النظر في وقت واحد إخراج البيانات من اختبارات بيولوجية هدانا في اختيار ثلاثة تركيزات معينة (وأبرزت في الشكل 4.1) على أساس (مرتفعة) مبلغ exopolysaccharides غير قابلة للذوبان و (تعزيز) التعبير عن gtfB (المسؤولة عن تجميع غلوكان غير قابلة للذوبان) في الأغشية الحيوية .
- ميكروأري التحليل. استخدمت مختارة (ثلاثة) تركيزات من الكربوهيدرات الغذائية لتشكيل الأغشية الحيوية ، والتي أزيلت في نقطة زمنية محددة تعكس المراحل المختلفة لعملية التنمية الأغشية الحيوية. تعرضت الأغشية الحيوية (مقسمة على 3 مجموعات تجريبية و 4 نقاط للوقت) لتحليل كامل عن طريق الجمع بين transcriptome التنميط الجيني (ميكروأرس [كدنا]) مع BRB - صفيف أدوات والمالديف.
تم استخراج الحمض النووي الريبي وتنقيتها باستخدام بروتوكول محددة بيوفيلم 12 ، ثم تعرض لميكروأري التحليل من خلال عملية خطوة 4 من صندوق الأدوات التحليلية. الشكل 4.2 يوضح كيفية MDV ساعدت على تحديد الجينات في المصالح وفقا لفرضية عملنا ان السكروز والنشا تركيبة مشغلات استجابة الترانسكربتي المحددة المرتبطة الفوعة محسن (المحتملة مسوس) س. الطافرة داخل الأغشية الحيوية. تمت معالجة البيانات الخام التي تم إنشاؤها بواسطة BRB - ArrayTools (الشكل 4.2a) بواسطة MDV باستخدام مخطط فين (الشكل 4.2b). في هذه الدراسة ، على مجموعة من الجينات المرتبطة فرضية لدينا هي تلك التي أعرب عنها في المقارنة تفاضليا A (0،5 ٪ سكروز + 1 ٪ مقابل 1 النشا السكروز ٪) و B (0.5 ٪ + النشا السكروز 1 ٪ مقابل 0،5 ٪ سكروز) ، ولكن ليس مقارنة الجينات في C (0.5 ٪ مقابل 1 سكروز سكروز ٪) (الشكل 4.2a 4.2b و). كما هو مبين في الشكل 4.2c ، وMDV انخفاض كبير في عدد من الجينات التي سيتم تحليلها وفي الوقت نفسه تصفية التدريجي الجينات لا علاقة مباشرة لتأثير السكروز والنشا في تركيبة كما تم تحويل مخرجات البيانات MDV إلى شاشة عرض رسومية تظهر البيانات التي نظمتها الدرجة الوظيفية لكل من الجينات وأعرب تفاضلي (أعلى وأسفل التنظيم) في نشا + السكروز - الأغشية الحيوية (مقابل السكروز نابعة من الأغشية الحيوية) في كل من النقاط الزمنية - 4 (الشكل 4.3). MDV البرنامج سهل الاستعمال وسهل التعدين / تنظيم البيانات الكبيرة والمعقدة مجموعات من التجارب ميكروأري لدينا. - وشملت بيوفيلم التصوير وفي الوقت نفسه ، تم تحليل التنظيم الهيكلي من الأغشية الحيوية باستخدام COMSTAT - DUOSTAT الأميرة في مربع الأدوات (انظر على سبيل المثال من إعادة الإعمار 3D والتحليل الكمي من النشاء + السكروز ، نمت بيوفيلم في الشكل 4.4 ، وانظر أيضا المادة الفيديو). يمكن أن يكون التشكل والتوزيع والعلاقة الهيكلية للEPS وmicrocolonies تصور استخدام 3D تقديم السطح بواسطة أميرة. يمكن أن تتولد عن قرب وجهات النظر من المنطقة المختارة ، والذي يوضح العلاقات الهيكلية المحددة البكتيريا EPS في microscale (الشكل 4.4). وعلاوة على ذلك ، يمكن معالجة نفس المجموعة من الصور التي مبائر DUOSTAT - COMSTAT عن الكتلة الحيوية / microcolony القياسات ، والتوزيع المكاني وcolocalization من الخلايا البكتيرية والعائد على السهم في نفس الوقت. على سبيل المثال ، تم احتساب ربحية السهم من التوزيع الرأسي والبكتيريا من سطح القرص للتخلص من السائل من كل قسم من الصور البصرية ثلاثية الأبعاد باستخدام بيوفيلم مبائر COMSTAT - DUOSTAT (الرسم البياني في الشكل 4.4 ، وانظر المادة الفيديو). وتشير البيانات إلى ارتفاع نسب العائد على السهم (خط أحمر) من بكتيريا (الخط الأخضر) عبر عمق الأغشية الحيوية. علاوة على ذلك ، وترتبط معظم الخلايا البكتيرية مع EPS (الخط الأزرق) ، وخاصة في الطبقات المتوسطة والخارجي للبيوفيلم. هذه الملاحظة تشير إلى أن الأغشية الحيوية التي تزرع في النشا والسكروز غنية وخاصة في exopolymers ، والتي هي enmeshing (على اتصال وثيق مع -) معظم الخلايا البكتيرية ، وتنظيم مثل هذه الهيكلية من شأنه أن يعزز الاستقرار والتماسك للالأغشية الحيوية 13. والاداءات ثلاثية الابعاد والقياسات الكمية من الصور مبائر تقديم معلومات إضافية حول هيكل بيوفيلم ، والتي تكمل البيانات البيوكيميائية والتعبير الجيني (زيادة GtfB من نوع غير قابل للذوبان غلوكان التجميعي الطافرة S. في النشا + السكروز نابعة من الأغشية الحيوية) (للحصول على أمثلة إضافية انظر 5 ، 6 ، 11 ، 13).
وأداة تحليلية بوكس ساعدتنا في الحصول على وتنظيم ودمج البيانات من اختبارات بيولوجية مختلفة ، والتي تقدم تحليلا شاملا لكيفية S. قد الطافرة الاستجابة للتغيرات البيئية المعقدة نتيجة لاتباع نظام غذائي في استضافة التفاعلات الموجودة في تجويف الفم (انظر التفاصيل في كلاين وآخرون ، 2009 (11) ؛. كلاين وآخرون ، 2010 7).
الشكل 1. التدفق البياني للأداة تحليلية لتحليل بوكس بيوفيلم.
الشكل 2. التصوير متحد البؤر من الإسفار EPS والبكتيريا في الأغشية الحيوية. في وقت واحد تصور EPS (الحمراء) ، والبكتيريا / microcolonies (الأخضر) في تقديم ثلاثي الأبعاد لبيوفيلم العقدية الطافرة شكلت على سطح القرص SHA.
الشكل 3. ميكروأري البيانات التعدين والمنظمة عن طريق البيانات ميكروأري متخيل (المالديف) البرمجيات. استخدام ميزة الرسم البياني فين لتحديد الجينات من المصالح ، وتليها إضافة اسم الجينات وظيفية الشرح الفئة.
الرقم 4.1. التقييم تشكيل بيوفيلم س. الطافرة باستخدام فحوصات البيوكيميائية (أ) و RT - qPCR (B). دائرة الهجرة والتجنيس (غير قابلة للذوبان exopolysaccharides) بيانات متطابقة تماما مع نمط من التعبير gtfB ومع الكتلة الحيوية من الأغشية الحيوية. والسكروز بنسبة 1 ٪ تركيز لتشكيل دائرة الهجرة والتجنيس الأقصى ، وحرية التعبير وتراكم gtfB بيوفيلم على السطح بينما شا السكروز 0.5 ٪ وكان تركيز الحد الأدنى المطلوب لتحقيق التنمية بيوفيلم الأمثل باستخدام نموذج لدينا في المختبر. S. الطافرة الخلايا المزروعة في وجود السكروز 0.5 ٪ + النشا أسفرت 1 ٪ أعلى الكتلة الحيوية ، وقدمت أكثر من دائرة الهجرة والتجنيس الأغشية الحيوية الأخرى ، والتي ترتبط مع التعبير gtfB محسن (B2). وقد تم اختيار هذه التركيزات الكربوهيدرات لتحليل transcriptome أخرى.
الرقم 4.2. ميكروأري تحليل البيانات باستخدام أدوات BRB - صفيف بالتعاون مع برنامج المالديف. أ) تمثيل عدد من الجينات المكتشفة كما أعرب تفاضلي في كل المقارنة (A ، B أو C) ، ونقطة زمنية تقييمها باستخدام أدوات BRB - صفيف. ب) البيانات ميكروأري متخيل (المالديف) باستخدام مخطط فين لتحديد الجينات في المصالح. ج) تحديد الجينات وفقا لMDV التحليل.
الرقم 4.3. S. الجينات الطافرة وأعرب تفاضلي في النشا + السكروز - الأغشية الحيوية (مقابل السكروز - الأغشية الحيوية) في مختلف نقاط في الوقت نظمته فئة وظيفية. وتستند شروح الجين على المعلومات المقدمة من قبل مختبر لوس ألاموس الوطني (www.oralgen.lanl.gov) أو عن طريق الكتابات المنشورة المتاحة في الموقع نفسه.
الرقم 4.4. ثلاثي الأبعاد تقديم وتحليل COMSTAT - DUOSTAT من النشا + السكروز - بيوفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العرض ، وأثبتنا عنصرين الحرجة للصندوق الأدوات التحليلية (EPS / البكتيريا ميكروأري التصوير واستخراج البيانات / التجهيز) ، وبراعة وفائدة مختلف المقايسات متكاملة في النظام. بوضوح ، وأداة مربع ، سهلت تحليل شامل (النسبية) في وقت واحد من جوانب مختلفة من الأغشية الحيوية الكيمياء الحيوية ، والهندسة المعمارية والتعبير الجيني في استجابة للظروف تجريبية مختلفة باستخدام نموذج في المختبر. 7 في اعتبارها التغيرات الديناميكية والمعقدة لل هيكلية المنظمة ، والاستجابات الفسيولوجية وtranscriptome س. الطافرة (ومسببات الأمراض الأخرى) في الأغشية الحيوية ، ويمكن تحليل متكامل يساعد على زيادة فهم كيفية الأغشية الحيوية المرضية تعدل في تجويف الفم. ونحن حاليا دمج الأنواع الخاصة وتحليل العلامات metagenomic / metaprotemic في مربع الأدوات التحليلية ، والتي من شأنها تعزيز القدرة على التحقيق في مزيد من التفاصيل التفاعلات المعقدة البيئية والتغيرات الهيكلية في نموذجنا بيوفيلم مختلط الأنواع. 5
وعلاوة على ذلك ، فإن هذه الأداة (وجميع اختبارات بيولوجية) مرنة ، قابلة للترقية مع إضافات (مثل metaproteome والسطحية التي يصعب تحليلها ، في التقدم) ، ويمكن تكييف / تعديل لتطبيقات البحوث بيوفيلم خارج الفم. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص MDV إلى حقول بيوفيلم الأخرى ذات الصلة باستخدام كامل الجينوم التنميط للمقارنة بين ظروف تجريبية متعددة ، مثل transcriptome المقارن سلالات (المسخ) واضح أو استجابة لعوامل علاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور غاري وشيه لي هربرت لتنمية المالديف. كما نشكر الدكاترة. سيموني دوارتي ، راميرو موراتا ، جون جاي كيو ، Abranches جاكلين ، والسيدة ستيسي غريغوار لمساهمتهم الفنية والعلمية لعناصر تحليلية من مربع الأدوات. وأيد هذه الدراسة في جزء من منحة بحثية USPHS DE018023 من المعهد الوطني لأبحاث طب الأسنان والجمجمة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | |
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | |
| Dextran conjugated alexa 647 | Invitrogen | D22914 | |
| Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope | Olympus Corporation |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R.
- Leme, P. aes, Koo, A. F., Bellato, H., Bedi, C. M., G, J. A. C. ury The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight. J Dent Res. 85, 878-887 (2006).
- Koo, H., Schobel, B. D., Scott-Annem, K., Watson, G., Bowen, W. H., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K. Apigenin and tt-farnesol with fluoride effects on S. mutans biofilms and dental caries. J Dent Res. 84, 1016-1020 (2005).
- Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. J Bacteriol. 192, 3024-3032 (2010).
- Jeon, J. G., Klein, M. I., Xiao, J., Gregoire, S., Rosalen, P. L., Koo, H. Influences of naturally occurring agents in combination with fluoride on gene expression and structural organization of Streptococcus mutans in biofilms. BMC Microbiol. 9, 228-228 (2009).
- Klein, M. I., DeBaz, L., Agidi, S., Lee, H., Xie, G., Lin, A. H. M., Hamaker, B. R., Lemos, J. A., Koo, H. Dynamics of Streptococcus mutans transcriptome in response to starch and sucrose during biofilm development. PLoS ONE. , 0013478-0013478 (2010).
- Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to Study the Physiology of Oral Biofilms. Methods Mol Biol. 666, 87-102 (2010).
- Koo, H., Hayacibara, M. F., Schobel, B. D., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K., Vacca-Smith, A. M., Bowen, W. H. Inhibition of Streptococcus mutans biofilm accumulation and polysaccharide production by apigenin and tt-farnesol. J Antimicrob Chemother. 52, 782-789 (2003).
- Koo, H., Seils, J., Abranches, J., Burne, R. A., Bowen, W. H., Quivey, R. G. Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 542-546 (2006).
- Klein, M. I., Duarte, S., Xiao, J., Mitra, S., Foster, T. H., Koo, H. Structural and molecular basis of the role of starch and sucrose in Streptococcus mutans biofilm development. Appl Environ Microbiol. 75, 837-841 (2009).
- Cury, J. A., Koo, H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms. Anal Biochem. 365, 208-214 (2007).
- Xiao, J., Koo, H. Structural organization and dynamics of exopolysaccharide matrix and microcolonies formation by Streptococcus mutans in biofilms. J Appl Microbiol. 108, 2103-2113 (2010).
- Thurnheer, T., Gmür, R., Shapiro, S., Guggenheim, B. Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque. Appl Environ Microbiol. 69, 1702-1709 (2003).
- Chalmers, N. I., Palmer, R. J. J. r, Du-Thumm, L., Sullivan, R., Shi, W., Kolenbrander, P. E. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl Environ Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Deng, D. M., Hoogenkamp, M. A., Ten Cate, J. M. >, Crielaard, W. Novel metabolic activity indicator in Streptococcus mutans biofilms. J Microbiol Methods. 77, 67-71 (2009).
