Summary
Biofilms נוצר על משטחי השן הם מורכבים מאוד חשוף מתמיד אתגרים סביבתיים מולד אקסוגניים, אשר לווסת את הארכיטקטורה שלהם, פיזיולוגיה transcriptome. פיתחנו ארגז הכלים לבחון את הרכב, ארגון מבניים ביטוי גנים של biofilms דרך הפה, אשר ניתן להתאים בתחומים אחרים של מחקר biofilm.
Abstract
Biofilms הם דינמיים מאוד, קהילות מאורגן ומובנה של תאים מיקרוביאליים לכוד במטריצה תאיים של צפיפות משתנה הרכב 1, 2. באופן כללי, biofilms להתפתח מצורף חיידקים הראשונית על משטח ואחריו היווצרות צבירי תאים (או microcolonies) ופיתוח ייצוב נוסף של microcolonies, אשר מתרחשים מטריצה תאיים מורכבים. רוב מטריצות biofilm exopolysaccharides הנמל (EPS), ו biofilms שיניים אינם יוצאים מן הכלל, במיוחד אלה הקשורים למחלת עששת, אשר מתווכת בעיקר על ידי mutans streptococci 3. EPS מסונתזים על ידי מיקרואורגניזמים (mutans ס, תורם מפתח) באמצעות אנזימים תאיים, כגון glucosyltransferases באמצעות סוכרוז בעיקר המצע 3.
מחקרים של biofilms נוצר על משטחי השן הם מאתגרת במיוחד בשל החשיפה המתמדת שלהם אתגרים סביבתיים הקשורים לתזונה מארח חיידקים יחסי הגומלין המורכבים המתרחשים בחלל הפה. הבנה טובה יותר של שינויים דינמיים של הארגון מבניים הרכב של מטריקס, פיזיולוגיה transcriptome / הפרופיל של proteome biofilm תאים בתגובה אלה אינטראקציות מורכבות היה לקדם את הידע הנוכחי של איך biofilms אוראלי לווסת pathogenicity. לכן, פיתחנו כלי אנליטי-box כדי להקל על ניתוח biofilm ברמות מבניים, ביוכימיים מולקולרית על ידי שילוב של טכניקות זמין בדרך כלל רומן עם תוכנת מחוייט לניתוח נתונים. סטנדרט אנליטי (מבחני colorimetric, RT-qPCR ו microarrays) וטכניקות הקרינה רומן (תיוג סימולטני של חיידקים EPS) שולבו עם תוכנה לניתוח נתונים ספציפיים לכתובת האופי המורכב של המחקר biofilm הפה.
הכלי תיבת מורכב 4 שלבים ברורים אך ביניהם (איור 1): 1) bioassays, 2) קלט נתונים גולמיים, 3) עיבוד נתונים 4) ניתוח נתונים. השתמשנו שלנו במבחנה biofilm מודל תנאים ניסויים ספציפיים כדי להדגים את התועלת והגמישות של תיבת הכלי. המודל biofilm היא פשוטה, לשעתקו מרובים משכפל ניסוי בודד ניתן לעשות בו זמנית 4, 5. יתר על כן, היא מאפשרת הערכה הזמני, הכללתם של מינים שונים של חיידקים 5 והערכה של ההשפעות של תנאים ניסויים שונים (למשל 6 טיפולים, השוואת מוטציות נוקאאוט מול הלחץ של ההורים 5; פחמימות זמינות 7). כאן אנו מתארים שני רכיבים ספציפיים של תיבת הכלי, כולל (i) תוכנה חדשה עבור microarray כריית נתונים / ארגון (MDV) וניתוח פלואורסצנציה הדמיה (DUOSTAT), וכן (ii) באתרה EPS-תיוג. אנו מספקים גם במקרה ניסיוני מראה כיצד הכלי תיבת יכולים לסייע בניתוח biofilms, נתוני הארגון, אינטגרציה ופרשנות.
Protocol
1. שלב 1 - bioassays
השיטה משתמשת biofilm דיסקים של hydroxyapatite (HA) כתחליף שן (קלרקסון כרומטוגרפיה Products, Inc, דרום Williamsport, פנסילבניה, ארה"ב; שטח = 2.7 ± 0.2 ס"מ 2) מצופה רוק (מחקה את נוכחותו של קרומית רכש), הניח במצב אנכי 4, 5, 8.
- מבחני ביוכימיים.
- Biofilms הם או (i) הומוגני ידי sonication 9 או (ii) ונשמרה שלמה מבחני ביוכימיים 8. המתלים biofilms הומוגני יכול לשמש להגדרה של ביומסה (משקל יבש), חלבון הכולל, אורגניים, וכן תאי ו תאיים סוכרים הרכב / תוכן (ראה פירוט Lemos et al. הפרוטוקולים ללמוד את הפיזיולוגיה של Biofilms אוראלי 8). Biofilms שלם יכול להיות מנותח על התגובות הפיזיולוגיות שלהם באמצעות תקן ה-pH glycolytic ושחרור, חומצה הרג, חדירות פרוטון ו-F-ATPase מבחני הפעילות (ראה פירוט Lemos et al. הפרוטוקולים ללמוד את הפיזיולוגיה של Biofilms אוראלי 8).
- ניתוח Transcriptome.
- תקן cDNA microarray ו RT-qPCR פרוטוקולים (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html למשל) ניתן להשתמש בשילוב לקביעת בתגובה-transcriptome של פתוגנים ספציפיים (למשל mutans ס) בתוך biofilms לאתגרים סביבתיים טיפוליות שונות בשלבים התפתחותיים שונים 6, 7, 10, 11. בתיבת הכלים, כללנו שתי שיטות כי הם קריטיים עבור ניתוח transcriptome של biofilms שיניים: 1) איכות RNA (בגלל האופי הטרוגניות של אוכלוסיות biofilm ונוכחות של EPS-matrix), ו 2) כריית נתונים ופרשנות (עקב נתונים גדולים לקבוע שנוצר על ידי microarray).
- בידוד RNA. כדי להתייחס לנושא איכות של RNA המופק biofilms, אנו משתמשים בפרוטוקול אופטימיזציה שפותחו במיוחד עבור בידוד RNA וטיהור של תאים חיידקיים לכוד בתוך EPS עשיר מטריקס 12 (http://dx.doi.org/10.1016/j . ab.2007.03.021). פרוטוקול זה מספק מספר RNA יושרה (רין) גבוה יותר מאשר 8.5, הנחשב אופטימלי לניתוח transcriptome הן באמצעות RT-qPCR ו microarrays (דוגמאות, ראה 6, 11).
- תקן cDNA microarray ו RT-qPCR פרוטוקולים (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html למשל) ניתן להשתמש בשילוב לקביעת בתגובה-transcriptome של פתוגנים ספציפיים (למשל mutans ס) בתוך biofilms לאתגרים סביבתיים טיפוליות שונות בשלבים התפתחותיים שונים 6, 7, 10, 11. בתיבת הכלים, כללנו שתי שיטות כי הם קריטיים עבור ניתוח transcriptome של biofilms שיניים: 1) איכות RNA (בגלל האופי הטרוגניות של אוכלוסיות biofilm ונוכחות של EPS-matrix), ו 2) כריית נתונים ופרשנות (עקב נתונים גדולים לקבוע שנוצר על ידי microarray).
- דימות פלואורסצנטי. ארגון מבני של biofilms.
- רוב הפרוטוקולים confocal דימות פלואורסצנטי זמין בספרות מתמקד תיוג מיקרוביאלי. הניתוח של EPS כמרכיב העיקרי של biofilm הוזנח במידה רבה במחקר biofilm אוראלי מעורבים דימות פלואורסצנטי, למעט חריגים בודדים 5, 13, 14. פיתחנו תיוג רומן טכניקה תוכנה ספציפית עבור להדמיה לשחזור וכימות EPS ו תאים חיידקיים בו זמנית בתוך biofilms ללא פגע. עמירה 5 (הפרצוף הדמיה GmbH, ברלין, גרמניה) משמש לשיקום 3D של biofilms, בעוד סטטמ"מ (זמין ב http://www.imageanalysis.dk) ו DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk) לספק את ניתוח כמותי.
- הדמיה של ארגון מבני של EPS-חיידקים biofilms. פלואוריד אלקסה 647 שכותרתו dextran המצומד משמש כדי להמחיש את EPS-matrix. Dextran ניאון שכותרתו משמש פריימר עבור סטרפטוקוקלי glucosyltransferases-Gtfs (במיוחד GtfB ו GtfC), וכן ניתן לשלב בו זמנית במהלך הסינתזה מטריצה exopolysaccharide במהלך biofilm פיתוח 11.
EPS תיוג:- Hydroxyapatite מעיל דיסקים עם הרוק פילטר סטריליות 1h, בעקבות "ההכנה biofilm" פרוטוקול 8.
- פיפטה 2.8 מ"ל של מדיום תרבות היטב כל אחד 24 צלחות היטב, מביאים בחדר חשוך.
- הוסף 1 מיקרומטר של dextran מצומדות אלקסה פלואוריד לתוך בינוני תרבות, לערבב צבע לתוך בינוני התרבות ידי pipetting למעלה ולמטה (כ -10 פעמים).
- טובלים לשטוף את הרוק מצופי HA (SHA) דיסקים (לאחר דגירה h 1) פעמיים AB חיץ סטרילי ולמקם אותם במדיום המכיל dextran מצומדות אלקסה פלואוריד.
- מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. משך זמן הדגירה תלוי כל עיצוב ניסיוני. Dextran שכותרתו fluorescently לא להכתים את תאים חיידקיים בריכוזים בשימוש זה כמולומר 11. אחרות EPS-מכתים טכניקות, כגון עם Calcofluor 14, ניתן להשתמש בשילוב.
- חיידקים תיוג:
- חיידקים רכיבים biofilms מסומנים בסוף היווצרות biofilm באמצעות תקן חומצות גרעין הניאון כתם (למשל SYTO 9); טכניקות פלואורסצנציה אחרים (כגון מינים ספציפיים ניאון שכותרתו נוגדנים 15 או GFP-לבטא בתאי 16) ניתן כמובן להשתמש כדי לאתר אחד או יותר מינים חיידקים biofilms. איור 2 מראה תיוג סימולטני של EPS (אדום) וחיידקים / microcolonies (ירוק) בתמונה 3D של 24 שעות הישן ס biofilm mutans נוצר על פני השטח של דיסק שא.
- רכישת תמונות: כל biofilm נסרק ב 5-10 עמדות שנבחרו באופן אקראי, ו-z הסדרה מופקים על ידי חתך אופטי בכל אחד תפקידים אלה על ידי לייזר מיקרוסקופיית confocal באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. אנו משתמשים ב FV אולימפוס 1000 שני הפוטונים מיקרוסקופ (אולימפוס, טוקיו, יפן) מצויד x10 (Carl Zeiss, הצמצם המספרי 0.45; עובד מרחק 3-4 מ"מ) או x25 (אולימפוס LPlan N; NA 1.05; WD 2 מ"מ) מים טבילה מטרות. גל עירור הוא 810 ננומטר, ופליטה באורך גל לסנן SYTO 9 (חיידקים) הוא 495/540 OlyMPFC1 לסנן, בעוד לסנן עבור Alexa פלואוריד 647 (EPS) הוא HQ655/40M-2P הסינון. שמור לאחסן תמונות גלם.
- הדמיה של ארגון מבני של EPS-חיידקים biofilms. פלואוריד אלקסה 647 שכותרתו dextran המצומד משמש כדי להמחיש את EPS-matrix. Dextran ניאון שכותרתו משמש פריימר עבור סטרפטוקוקלי glucosyltransferases-Gtfs (במיוחד GtfB ו GtfC), וכן ניתן לשלב בו זמנית במהלך הסינתזה מטריצה exopolysaccharide במהלך biofilm פיתוח 11.
- רוב הפרוטוקולים confocal דימות פלואורסצנטי זמין בספרות מתמקד תיוג מיקרוביאלי. הניתוח של EPS כמרכיב העיקרי של biofilm הוזנח במידה רבה במחקר biofilm אוראלי מעורבים דימות פלואורסצנטי, למעט חריגים בודדים 5, 13, 14. פיתחנו תיוג רומן טכניקה תוכנה ספציפית עבור להדמיה לשחזור וכימות EPS ו תאים חיידקיים בו זמנית בתוך biofilms ללא פגע. עמירה 5 (הפרצוף הדמיה GmbH, ברלין, גרמניה) משמש לשיקום 3D של biofilms, בעוד סטטמ"מ (זמין ב http://www.imageanalysis.dk) ו DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk) לספק את ניתוח כמותי.
2. שלב 2 - RAW נתוני קלט
נתוני קלט גלם מבחני ביוכימיים RT-qPCR ישירות לתוך קובץ נתונים גולמי (RDF-MS קובץ Excel). לקבלת נתונים microarrays, עומס יחיד הערוץ תמונות של שקופיות שנסרקו לתוך JCVI Spotfinder (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics.html) או תוכנה דומה. יצירת רשת במקום על פי מפרט JCVI ואז להתאים באופן ידני כדי להתאים את כל הנקודות בתוך הרשת. מדוד את ערכי העוצמה של כל מקום ולשמור לתוך ". MeV" קבצים המאוחסנים לתוך "נתונים גולמיים microarray".
3. שלב 3 - עיבוד נתונים
ארגן את הנתונים הגולמיים (ביוכימיות RT-qPCR) ב RDF לניתוח סטטיסטי. העברת אותם "קובץ נתונים מעובדים" (DPF - קובץ MS-Excel). לניתוח הדמיה microarray ו פלואורסצנטי, תוכנות ספציפיות (זמין כרגע מחוייט) משמשים כדי לעבד את הנתונים.
- Microarray נתונים:
- שלח את הנתונים הגולמיים שנוצר בשלב 2 (מאוחסן לתוך "נתונים microarrays גלם") לשלב נורמליזציה נתונים באמצעות תוכנה ספציפית. נרמל נתונים באמצעות microarray JCVI ניתוח נתונים תוכנה MIDAS (http://www.tm4.org/midas.html). השתמש LOWESS ואת הסדרה סטיית תקן עם הגדרות ברירת המחדל, ואחריו ניתוח לשכפל שקופיות. אחסן את הקבצים המכילים את הנתונים מנורמל. בשלב זה (נתוני הגלם קבצים מנורמל קבצי נתונים מוכן), להפקיד נתוני microarray באתר גישה ציבורית (למשל צמח השדה Gene Expression אומניבוס (GEO) נתונים על http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo), ולהקליט את המספר ההצטרפות לשימוש עתידי.
- פלואורסצנטי הדמיה נתונים
- Biofilm כימות המבנה.
- הנתונים הכמותיים המתאים כל רכיב מבניים (EPS וחיידקים) של biofilms מחושב על ידי סטטמ"מ ואת DUOSTAT החדש שפותח, שהיו כפי שנכתב התסריט MATLAB 5.1. התמונות הקרינה הגלם נטען בתוכנה ונותחו כדלקמן:
- השתמש סטטמ"מ לחשב ביומסה, עובי, הפצה שכבת ופרמטרים נוספים אשר לכמת ולאפיין את המבנה tridimensional של biofilms (ראה ידני בכל http://www.imageanalysis.dk).
- השתמש DUOSTAT לחשב את שיתוף לוקליזציה של שני מרכיבים biofilm, כגון חיידקים EPS (או מינים של חיידקים שונים ו / או מרכיבים תאיים):
- הגדר את הנתיב של DUOSTAT ב MATLAB 5.1, ותיקיות הכוללות תמונה לפתוח את התמונות של שני הרכיבים biofilm.
- בחר את שני הערוצים שיהיו מתואמים ונותחו. שתי ערימות תמונה חייבת להיות גם גודל פיקסל זהה בכל שלושת הממדים (x, y, z), וכן אותו מספר של תמונות בערימה אחד.
- הגדרת הסף עבור כל ערוץ לפי האישרע"מ של סטטמ"מ. פעל לפי ההוראות בממשק התוכנה המבצע (ראה מאמר וידאו; ידני DUOSTAT ב http://www.imageanalysis.dk). קלט נתונים המתקבלים לתוך DPF. ראו דוגמה באיור 4.4.
- תלת ממדי biofilms השיקום.
- ארכיטקטורה תלת ממדי של biofilms היא דמיינו באמצעות אמירה. ייבא את התמונות המאוחסנות הקרינה לתוך "תיקיות תמונות Raw" לתוך התוכנה, ולהשתמש טיוח voltex ו-ISO-משטח ליצור 3-D renderings של כל אחד מהמרכיבים של biofilms (ראה עמירה ידני בכל http://www.amira.com / תיעוד / מדריכים-and-שחרור-notes.html). ראה למשל על איור 4.4.
- הנתונים הכמותיים המתאים כל רכיב מבניים (EPS וחיידקים) של biofilms מחושב על ידי סטטמ"מ ואת DUOSTAT החדש שפותח, שהיו כפי שנכתב התסריט MATLAB 5.1. התמונות הקרינה הגלם נטען בתוכנה ונותחו כדלקמן:
- Biofilm כימות המבנה.
4. שלב 4 - ניתוח נתונים
נתונים כמותיים מתוך ביוכימיים, RT-qPCR ו-סטטמ"מ DUOSTAT מבחני ב DPF מוכנים לניתוח סטטיסטי. לאחר ניתוח סטטיסטי מתבצע, גרפים ו / או טבלאות ניתן לבנות (ראה "תוצאות נציג" בסעיף).
1. Microarray נתוני הארגון באמצעות תוכנה microarray נתונים Visualizer (MDV).
בשל המורכבות ואת התפוקה של ערכות נתונים גדולות בעת שימוש microarrays ואת תנאי הניסוי מרובים, עיצבנו כריית נתונים וארגון תוכנה בשם microarray נתונים Visualizer (MDV) 7 (זמין ב http://www.oralgen.lanl.gov/) .
לאחר ביצוע ניתוח סטטיסטי באמצעות BRB-ArrayTools (http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) עם ערך של 0.001 הפסקת P לחיזוי בכיתה לצורך השוואה בכיתה, נתונים שנוצר ניתן להגיש כדי MDV, כדלקמן:
- באמצעות Excel, להמיר את הנתונים אל BRB MDV מופרד באמצעות טאבים קבצי טקסט. הסר את כל המכתבים שמגיעים עם מספר לוקוס ג'ין תג, למשל: SMU.1423c, מחק את האות "c".
- פתח MDV. עבור אל הקובץ ובחר "בחירת מקור הסברים". בחר "קובץ שטוח". כאשר הציג עם תיבת הדו שיח, להשתמש בלחצני עיון כדי לבחור את הקבצים המכילים ביאור שם הגן, אונטולוגיה ג'ין (GO) מספר, מסלול, ונתונים סיווג פונקציונלי.
- עבור אל קובץ, ולייבא כל אחד מהקבצים מסעיף 1. כל הקבצים מייצג את תנאי הניסוי לניתוח. אם ישנם מספר תנאים לצורך ניתוח, למשל שני טיפולים שונים (טיפול 1 ו -2) שליטה (רכב) ללכת פריט 4.
- במקרה זה, ההשוואות האפשריות הן: (א) 1 טיפול לעומת הביקורת (עבור גנים הביע דיפרנציאלי עקב טיפול 1), (ב) טיפול 2 לעומת שליטה; ו (ג) 1 טיפול לעומת טיפול 2. בהתאם להשערה עבודה, קבוצה שונה של גנים ניתן לבחור.
- בחר גנים בלבד הביעו דיפרנציאלי בהשוואה (גנים ייחודיים מושפע טיפול 1 בלבד). במקרה זה, להשתמש בפונקציה הפחת מתפריט הגדרת תפקידי. הפחת את הגנים מ-B מ-A השוואה, ולשמור את התוצאה. ואז, לחסר C מן הנתונים המתקבלים. הפעולות אותן ניתן לעשות כדי לקבל רק את הגנים B (גנים ייחודיים מושפע טיפול 2 בלבד).
- כדי לבחור רק את הגנים שאותרו הן A ו-B, השתמש בפונקציה האיחוד מתפריט הגדרת פונקציות לשלב את התוצאה להשוואות A ו-B, ולשמור את התוצאה. ואז לחסר C מהנתונים התוצאה.
- פעולות אלה ניתן דמיינו באמצעות דיאגרמת ון, בהשתתפות MDV, שהוא אינטואיטיבי יותר, ומקל על השערה מונחה ארגון נתונים. פלט הנתונים ון תרשים יוצג המסך (ראו את תצוגת המסך באיור 3 וסעיף וידאו).
- כדי לשמור את הנתונים מופרד באמצעות טאבים קבצי טקסט, עבור אל קובץ ובחרו ייצוא.
- ייצוא מופרד באמצעות טאבים קבצי טקסט. פתח אותם באמצעות Excel, לארגן את פלט נתונים MDV בטבלאות ו / או סמויה לתצוגה גרפית (ראה איורים 4.2, 4.3 ו מאמר וידאו).
5. נציג תוצאות
כאן אנו מספקים דוגמה לאופן שבו כלי אנליטי תיבת משלב את מבחני שונים של מחקר biofilm עם משתנים מרובים תנאי הניסוי.
ניסיוני במקרה:
דינמיקה של Streptococcus mutans transcriptome בתגובה עמילן סוכרוז במהלך biofilm פיתוח 7.
רקע:
אינטראקציות של עמילן סוכרוז תזונתיים עם עמילאז מארח הרוק glucosyltransferases סטרפטוקוקלי יכול לשפר את היווצרות ארסיות ש mutans בתוך biofilms ידי increasing exopolysaccharides סינתזה, מטבוליזם הסוכר acidogenicity 11. זו אינטראקציה מורכבת מארח הפתוגן דיאטה עשויה לווסת את היווצרות biofilms פתוגניים הקשורים למחלת עששת. ערכנו ניתוח ביוכימיות transcriptomic מקיפה (כולל אפיון גנטי שלם) כדי לקדם להבין איך ס mutans מגיב עמילן סוכרוז בשלבים שונים של פיתוח biofilm בנוכחות עמילאז 7.
אנליטית הכלי תיבת שימש לסייע לנו שילוב מבחני ביוכימיים המולקולרי של biofilms נוצרו תחת תנאים ניסויים שונים ונקודות זמן. התפוקה הכוללת נתונים באמצעות כלי אנליטי תיבת מוצג באופן רציף באיור 4 (4.1-4.4). ראוי לציין כי המוקד העיקרי כאן היא להדגים את התועלת של תיבת כלי ולא פרשנות נתונים לדיון.
- שילוב מבחני ביוכימיים RT-qPCR כדי לבחור את תנאי הניסוי microarrays לניתוח נוסף. בתחילה, בדקנו 6 סוכרוז נבדל 5 עמילן סוכרוז שילובים שונים כדי לבחור את הריכוזים האופטימלי של פחמימות לפיתוח biofilms ידי ש mutans באמצעות המודל שלנו במבחנה. היכולת לבחון בו זמנית את הפלט נתוני bioassays שהנחו אותנו בבחירת בשלושה ריכוזים ספציפיים (מסומן באיור 4.1) בהתבסס על כמות (גבוהות) של exopolysaccharides מסיס ו (משופרת) ביטוי gtfB (אחראי סינתזה גלוקן מסיסים) ב biofilms .
- ניתוח microarray. שנבחר (שלושה) ריכוזים של פחמימות בתזונה שימשו כדי ליצור biofilms, אשר הוסרו בזמן נקודות ספציפיות המשקף את השלבים השונים של תהליך הפיתוח biofilms. Biofilms (מחולק ב 3 קבוצות הניסוי 4 זמן נקודות) עברו ניתוח transcriptome על ידי שילוב של פרופיל גנטי שלם (microarrays cDNA) עם BRB-מערך כלים MDV.
RNA הופק וטיהר באמצעות biofilm ספציפי פרוטוקול 12, ולאחר מכן נתון microarray לניתוח באמצעות תהליך שלב 4 של ארגז הכלים, אנליטית. איור 4.2 מדגים כיצד MDV עזר כדי לבחור את הגנים של עניין על פי הנחת העבודה שלנו, כי שילוב סוכרוז ועמילן מעורר תגובה תעתיק ספציפיות הקשורות ארסיות משופרת (פוטנציאל cariogenic) ש mutans בתוך biofilms. הנתונים הגולמיים שהופקו על ידי BRB-ArrayTools (איור 4.2a) היה מעובד על ידי MDV באמצעות דיאגרמת ון (איור 4.2b). במחקר זה, הקבוצה של גנים הקשורים ההשערה שלנו הם אלה לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי לעומת (0.5% סוכרוז + 1 עמילן סוכרוז% לעומת 1%) ו-B (0.5% סוכרוז + עמילן 1% לעומת 0.5% סוכרוז), אך לא את הגנים בהשוואה C (סוכרוז 0.5% לעומת 1% סוכרוז) (איור 4.2a ו - 4.2b). כפי שניתן לראות בתרשים 4.2c, MDV במידה רבה הפחיתה את המספר הכולל של הגנים להיות מנותח באותו זמן לסנן החוצה את הגנים שאינם קשורים ישירות ההשפעה של סוכרוז ועמילן בשילוב. פלט הנתונים MDV הוסב גם לתצוגה גרפית המראה את נתוני מאורגן על ידי המעמד הפונקציונלי של כל אחד מן הגנים הביע דיפרנציאלי (למעלה ולמטה, מוסדר) ב העמילן + סוכרוז-biofilms (לעומת סוכרוז גדל biofilms) בכל אחד של 4 נקודות זמן (איור 4.3). התוכנה MDV הוא ידידותי למשתמש הקל הכרייה / ארגון של נתונים גדולים ומורכבים קובע מניסויים microarray שלנו. - . Biofilm הדמיה במקביל, הארגון המבני של biofilms נותח באמצעות סטטמ"מ-DUOSTAT-עמירה כלול תיבת הכלי (ראה דוגמה לשיקום 3D ו ניתוח כמותי של העמילן + סוכרוז מבוגר biofilm באיור 4.4; גם לראות מאמר וידאו). מורפולוגיה, הפצה היחסים המבניים של EPS ו microcolonies ניתן דמיינו באמצעות טיוח משטח 3D של עמירה. תקריב תצוגות של האזור הנבחר יכול להיות שנוצר, אשר ממחישה יחסים מבניים ספציפיים חיידקים EPS ב microscale (איור 4.4). יתר על כן, אותה קבוצה של תמונות confocal יכול להיות מעובד על ידי DUOSTAT-סטטמ"מ עבור ביומסה / microcolony מדידות, הפצה colocalization מרחבית של תאים חיידקים EPS בו זמנית. לדוגמה, החלוקה האנכית של EPS חיידקים ממשטח דיסק שלב נוזל חושבה מתוך כל מקטע אופטי של תמונות תלת ממדיות באמצעות biofilm confocal סטטמ"מ-DUOSTAT (הגרף באיור 4.4:. עיין במאמר וידאו). הנתונים מראים לממדים גבוהים יותר של EPS (קו אדום) מאשר חיידקים (הקו הירוק) על פני עומק biofilms. יתר על כן, רוב תאים חיידקיים המשויכים EPS (הקו הכחול), במיוחד בשכבות הביניים החיצוני של biofilm. תצפית זו מצביעה על כך biofilms גדל עמילן סוכרוז עשירים במיוחד exopolymers, אשר וסיבכה (במגע קרוב עם) ביותר של תאים חיידקיים, ארגון מבני כזה משפר את יציבות לכידות של biofilms 13. תלת מימדי הדמיות ומדידות כמותיות של תמונות confocal לספק מידע נוסף על מבנה biofilm, אשר משלים את הנתונים ביטוי ביוכימיות גן (עלה GtfB מסוג גלוקן מסיסים, על ידי סינתזה mutans ס בעמילן + סוכרוז גדל biofilms) (לדוגמאות נוספות ראה 5, 6, 11, 13).
כלי אנליטי-Box סייעו לנו להשיג, לארגן ולשלב את הנתונים bioassays שונים, אשר סיפק ניתוח מקיף של כמה ס mutans עשויים להגיב לשינויים סביבתיים מורכבים כתוצאה דיאטה מארח אינטראקציות נמצא בחלל הפה (ראה פירוט קליין et al, 2009 11,.. קליין et al, 2010 7).
באיור 1. Flow-תרשים של כלי אנליטי לניתוח-Box biofilm.
איור 2. דימות פלואורסצנטי Confocal של EPS ו חיידקים Biofilms. להדמיה סימולטני של EPS (אדום) וחיידקים / microcolonies (ירוק) בעיבוד תלת ממדי של biofilm Streptococcus mutans שנוצר על פני הדיסק שא.
איור 3. Microarray כריית נתונים וארגון שימוש microarray נתונים Visualizer (MDV) תוכנה. השימוש בתכונה תרשים ון כדי לבחור את הגנים של עניין, ואחריו תוספת של שם הגן ביאור מעמד פונקציונלי.
איור 4.1. הערכת היווצרות biofilm ש ' mutans באמצעות מבחני ביוכימיים (א) ו RT-qPCR (B). הנתונים INS (exopolysaccharides מסיסים) לתאם היטב עם דפוס הביטוי gtfB, עם ביומסה של biofilms. סוכרוז על 1% היה ריכוז להיווצרות אח"י מקסימלית, הביטוי gtfB וצבירת biofilm על פני השטח SHA בעוד 0.5% סוכרוז היה הריכוז המינימלי הנדרש לפיתוח biofilm אופטימלי באמצעות שלנו במודל חוץ גופית. S. mutans תאים בוגרים בנוכחות סוכרוז 0.5% + עמילן 1% הניב את ביומסה הגבוהה ביותר, והציג אח"י יותר biofilms אחרים, אשר מתואמים עם הביטוי gtfB משופרת (B2). ריכוזים אלה פחמימות נבחרו לניתוח transcriptome נוספת.
איור 4.2. Microarray ניתוח נתונים באמצעות BRB-מערך כלי בשילוב עם תוכנת MDV. א) מייצגים את מספר הגנים שזוהו כפי שבאה לידי ביטוי באופן שונה בהשוואה לכל (A, B או C) נקודת זמן להעריך באמצעות BRB-מערך כלים. ב) microarray נתונים Visualizer (MDV) באמצעות דיאגרמת ון כדי לבחור את הגנים של עניין. ג) גנים נבחרים על פי ניתוח MDV.
איור 4.3. S. גנים mutans הביע דיפרנציאלי בעמילן + סוכרוז-biofilms (לעומת סוכרוז-biofilms) בשעה שונות בזמן נקודות שאורגן על ידי המחלקה תפקודית. הסברים ג'ין מבוססים על מידע המסופק על ידי המעבדה הלאומית לוס אלמוס (www.oralgen.lanl.gov) או ספרות שפורסם זמין באתר האינטרנט של אותו.
איור 4.4. תלת ממדי טיוח סטטמ"מ-DUOSTAT ניתוח של עמילן + סוכרוז-biofilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במצגת זו, הראינו שני מרכיבים קריטיים של ארגז הכלים, אנליטי (EPS / חיידקים הדמיה microarray כריית נתונים / עיבוד), את הרבגוניות והתועלת של מבחני שונים משולבים במערכת. ברור, הכלי תיבת הקלו ניתוח מקיף (היחסי) בו זמנית של היבטים שונים של ביוכימיה biofilms, אדריכלות ביטוי גנים בתגובה תנאים ניסויים שונים תוך שימוש במודל חוץ גופית. 7 בהתחשב שינויים דינמיים ומורכבים של ארגון המבני, תגובות פיזיולוגיות transcriptome ש ' mutans (ומזיקים) ב biofilms, ניתוח משולב יכול לעזור עוד יותר להבין כיצד biofilms לווסת pathogenicity בחלל הפה. כרגע אנחנו שילוב של מינים ספציפיים תיוג וניתוח metagenomic / metaprotemic בתיבת כלים אנליטיים, אשר היה לשפר את היכולת לחקור ביתר פירוט את האינטראקציות האקולוגיות מורכבים ושינויים מבניים המודל שלנו מעורב מינים biofilm 5.
יתר על כן, הכלי הזה (וכל bioassays) הוא לשדרוג גמישה, עם תוספות (כגון metaproteome וקשה פני ניתוח: התקדמות), וכן ניתן להתאים / שונה עבור יישומים מחוץ מחקר biofilm הפה. לדוגמה, MDV יכול להיות מועיל במיוחד biofilm הקשורות בתחומים אחרים באמצעות אפיון הגנום כולו לצורך השוואה של תנאי הניסוי מרובים, כגון השוואתי-transcriptome של (מוטציה) זנים שונים או בתגובה סוכני טיפולית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות ד"ר גארי שיה והרברט לי לפיתוח MDV. אנו מודים גם בני הזוג. סימון דוארטה, רמירו Murata, Jae-Gyu Jeon, Abranches ז'קלין, גב 'סטייסי Gregoire על תרומתו טכני ומדעי שלהם עבור רכיבי אנליטית של תיבת הכלי. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק מחקר USPHS DE018023 מהמכון הלאומי למחקר דנטלי Craniofacial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | |
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | |
| Dextran conjugated alexa 647 | Invitrogen | D22914 | |
| Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope | Olympus Corporation |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R.
- Leme, P. aes, Koo, A. F., Bellato, H., Bedi, C. M., G, J. A. C. ury The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight. J Dent Res. 85, 878-887 (2006).
- Koo, H., Schobel, B. D., Scott-Annem, K., Watson, G., Bowen, W. H., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K. Apigenin and tt-farnesol with fluoride effects on S. mutans biofilms and dental caries. J Dent Res. 84, 1016-1020 (2005).
- Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. J Bacteriol. 192, 3024-3032 (2010).
- Jeon, J. G., Klein, M. I., Xiao, J., Gregoire, S., Rosalen, P. L., Koo, H. Influences of naturally occurring agents in combination with fluoride on gene expression and structural organization of Streptococcus mutans in biofilms. BMC Microbiol. 9, 228-228 (2009).
- Klein, M. I., DeBaz, L., Agidi, S., Lee, H., Xie, G., Lin, A. H. M., Hamaker, B. R., Lemos, J. A., Koo, H. Dynamics of Streptococcus mutans transcriptome in response to starch and sucrose during biofilm development. PLoS ONE. , 0013478-0013478 (2010).
- Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to Study the Physiology of Oral Biofilms. Methods Mol Biol. 666, 87-102 (2010).
- Koo, H., Hayacibara, M. F., Schobel, B. D., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K., Vacca-Smith, A. M., Bowen, W. H. Inhibition of Streptococcus mutans biofilm accumulation and polysaccharide production by apigenin and tt-farnesol. J Antimicrob Chemother. 52, 782-789 (2003).
- Koo, H., Seils, J., Abranches, J., Burne, R. A., Bowen, W. H., Quivey, R. G. Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 542-546 (2006).
- Klein, M. I., Duarte, S., Xiao, J., Mitra, S., Foster, T. H., Koo, H. Structural and molecular basis of the role of starch and sucrose in Streptococcus mutans biofilm development. Appl Environ Microbiol. 75, 837-841 (2009).
- Cury, J. A., Koo, H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms. Anal Biochem. 365, 208-214 (2007).
- Xiao, J., Koo, H. Structural organization and dynamics of exopolysaccharide matrix and microcolonies formation by Streptococcus mutans in biofilms. J Appl Microbiol. 108, 2103-2113 (2010).
- Thurnheer, T., Gmür, R., Shapiro, S., Guggenheim, B. Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque. Appl Environ Microbiol. 69, 1702-1709 (2003).
- Chalmers, N. I., Palmer, R. J. J. r, Du-Thumm, L., Sullivan, R., Shi, W., Kolenbrander, P. E. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl Environ Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Deng, D. M., Hoogenkamp, M. A., Ten Cate, J. M. >, Crielaard, W. Novel metabolic activity indicator in Streptococcus mutans biofilms. J Microbiol Methods. 77, 67-71 (2009).
