En este informe se describe un método para el aislamiento y la cultura de los nichos de células progenitoras de los riñones de embriones de ratón que pueden utilizarse para estudiar las vías de señalización que regulan células madre / progenitoras de los riñones en desarrollo. Estas células cultivadas son muy accesibles a pequeñas moléculas y tratamiento de proteínas recombinantes, y esto es importante también para la transducción viral, que permite la manipulación eficiente de las vías de candidato.
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Artículo de método
Aislamiento y cultivo de células de la zona nefrogénica del riñón de embriones de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo embrionario del riñón ha sido ampliamente estudiado como un modelo para la interacción epitelio-mesénquima en la organogénesis y para ganar la comprensión de los orígenes de la enfermedad renal congénita. Más recientemente, la posibilidad de dirigir ingenuo células madre embrionarias hacia destinos nefrogénica ha sido explorada en el campo emergente de la medicina regenerativa. Los estudios genéticos en ratones han identificado varios caminos necesarios para el desarrollo del riñón, y un catálogo global de la transcripción de genes en el órgano ha sido recientemente generada http://www.gudmap.org/ , proporcionando numerosas candidato reguladores de las funciones esenciales del desarrollo. Organogénesis del riñón de roedores puede ser estudiado en cultivos de órganos, y muchos informes se ha utilizado este enfoque para analizar los resultados de la aplicación de cualquiera de las proteínas candidatas o derribar la expresión de genes candidatos mediante siRNA o morfolinos. Sin embargo, la aplicabilidad de la cultura de órganos para el estudio de la señalización que regula la madre / la diferenciación de células progenitoras en comparación con la renovación en el riñón en desarrollo es limitado, como órganos cultivados contienen una difusión compacta de la matriz extracelular limitación de las macromoléculas y las partículas de virus. Para el estudio de la señalización celular eventos que influyen en la madre / nicho de células progenitoras en el riñón, hemos desarrollado un sistema de célula primaria que establece la zona nefrogénica o nicho de células progenitoras de la ex vivo de riñón en desarrollo en el aislamiento del inductor de la diferenciación del epitelio. Utilizando digestión enzimática limitada, las células de la zona nefrogénica puede ser liberado de forma selectiva el desarrollo de los riñones en E17.5. Después de la filtración, estas células pueden ser cultivadas en una monocapa irregular con las condiciones más favorables. Análisis de marcadores de genes demuestra que estos cultivos contienen una distribución de los tipos celulares característicos de la zona nefrogénica en vivo, y que mantienen la expresión adecuada del gen marcador durante el período de cultivo. Estas células son muy accesibles a pequeñas moléculas y tratamiento de proteínas recombinantes, y esto es importante también para la transducción viral, lo que facilita enormemente el estudio de los candidatos madre / progenitoras efectos sobre las células del regulador. Parámetros básicos de biología celular como la proliferación y muerte celular, así como cambios en la expresión de marcadores moleculares característicos de la nefrona células madre / progenitoras in vivo puede ser utilizado con éxito como los resultados experimentales. Trabajo en curso en nuestro laboratorio con esta nueva técnica de células primarias tiene como objetivo descubrir los mecanismos básicos que rigen la regulación de la auto-renovación versus diferenciación en nefrona células madre / progenitoras.
Protocolo
1. Preparación de los reactivos para la digestión del Riñón
- 1,5 ml de 0,25% de colagenasa A (w / v) y una solución de pancreatina digerir% (w / v) serán necesarios para la extracción de células de la zona nefrogénica (NZCs) de 8 E17.5 riñones. Debido a la pancreatina de aproximadamente 2 horas para disolver a temperatura ambiente, lo suficiente para digerir la solución al mayor número de riñones embrionarios espera que debe hacer antes del experimento. Prepare una solución digerir primero la adición de 25 mg de colagenasa A 10 ml de fosfato de Dulbecco solución salina tamponada (DPBS) en un claro de 15 ml, tubo de centrífuga estéril. Es muy importante que ....
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Discusión
En este protocolo se describe un método para aislar y cultivar células de la zona nefrogénica del riñón embrionario. Es el desarrollo de un método publicado inicialmente como parte de un estudio de los efectos de BMP7 tratamiento de las células de la zona nefrogénica (al blanco y otros., 2009). En el estudio inicial, una serie de experimentos para caracterizar los tipos de células representadas en la población NZC se llevaron a cabo. En pocas palabras, la purificación de NZCs de los periodistas genétic.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el R01 DK078161 de NIDDK (LO), becas postdoctorales de la American Heart Association (AB), la Fundación Wenner-Gren de Suecia y Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Suecia (UB). Apoyo adicional fue proporcionada por el Centro Médico de Maine instalaciones centrales del Instituto de Investigación para la histopatología, Bioinformática y FACS (apoyado por 2P20RR18789-06) y el Fondo para el Animal MMCRI.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Relojero’s fórceps n.º 5 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4905 | 2 pares requeridos |
| Colagenasa A | Grupo Roche | 10 103 578 001 | Usar mascarilla |
| Pancreatina porcina | Sigma-Aldrich | P8096 | Usar mascarilla |
| DPBS con Ca, Mg | Lonza Inc. | 17-513F | Con Mg &y Ca |
| Suero bovino fetal (SBF) | BioWhittaker | 14-901E | |
| HBSS | GIBCO, por Life Technologies | 14175 | |
| KSFM | GIBCO, por Life Technologies | 10724-011 | sin factores de crecimiento añadidos |
| L-glutamina 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513 | Usar al 1% v/v |
| PenStrep 10.000 U de penicilina/ml, 10 mg de estreptomicina/ml | Sigma-Aldrich | P4333 | Usar al 1% v/v |
| Fibronectina | BD Biosciences | 356008 | Suministrado en forma de polvo |
| placa de cultivo de 24 pocillos | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | Nunclon |
| DPBS sin Mg &y Ca | Lonza Inc. | 17-512F | |
| tubos de poliestireno de 5 mL | BD Biosciences | 352235 | |
| DNasa (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl por 1,5 ml |
| Filtro celular de 40 micrones | BD Biosciences | 352235 | con tapa y tubo |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | P6148 | Usar al 4 % p/v |
| Triton X-100 | VWR international | VW3929-2 | Usar al 0,3 % v/v |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Suministrado en forma de polvo |
| Suero de asno | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Usar al 5 % v/v |
| Conejo anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Diluir 1:100 |
| Anticuerpo anti-conejoβ-gal | MP Biomedicals | 559762 | Diluir 1:200 |
| Oregon Green 488 faloidina | Invitrogen | O7466 | Diluir 1:200 |
| Anticuerpo secundario de asno anti-conejo Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Diluir 1:200 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Diluir 1:5000 |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glicerol | EMD Millipore | GX0185-6 | Mezcle 50 % con H2O |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Uso "DNasa en columna" protocolo |
| Pipetas Pasteur, 3 ml | BD Biosciences | 357575 |
Referencias
- Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism. Development. 136, 3557-3566 (2009).
- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P.
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Reimpresiones y permisos
