Para evaluar la In vivo Efectos de las intervenciones terapéuticas para la enfermedad de los músculos, los métodos son necesarios para cuantificar la generación de fuerza y fatiga en el músculo tratado. Se detalla un método para la evaluación de myo-propiedades mecánicas de los músculos explantados extremidad posterior del ratón. Este análisis proporciona un enfoque sólido para la cuantificación de los efectos de la modificación genética en la función muscular, así como la comparación de las terapias en modelos de ratón de la enfermedad muscular.
Artículo de método
Myo-mecánico Análisis de músculo esquelético aislado
En este artículo
Resumen
Resumen
Para evaluar los efectos in vivo de las intervenciones terapéuticas para el tratamiento de enfermedades musculares 1,2,3, los métodos cuantitativos son necesarios para medir la fuerza y la generación de fatiga en el músculo tratado. Se describe un enfoque detallado para la evaluación de myo-propiedades mecánicas en el músculo recién explantados extremidad posterior del ratón. Se describe la cosecha atraumática del ratón músculo extensor largo de los dedos, el montaje del músculo en el músculo tira miografía (Modelo 820MS, Danés de Tecnología Myo), y la medición de la contracción máxima y la tensión tetánica, el tiempo de contracción y relajación de medio tiempo, con un pulso cuadrado estimulador (modelo S48, Tecnologías de la hierba). El uso de estas mediciones, se demuestra el cálculo de la contracción específica y la tensión muscular tetánica normalizado a la sección transversal, el tic-a-tetánica relación de tensión, la curva de la relación fuerza-frecuencia y la curva de la fatiga de baja frecuencia 4. Este análisis proporciona un método de comparación cuantitativa entre las intervenciones terapéuticas en modelos de ratón de la enfermedad del músculo 1,2,3,5, así como la comparación de los efectos de la modificación genética en la función muscular 6,7,8,9.
Protocolo
El protocolo se lleva a cabo con la aprobación de la UCSF Cuidado de Animales institucional y el empleo (IACUC).
1. La disección de la Longo ratón Extensor de los dedos (EDL) del músculo
- Realizar todos los procedimientos con animales, de acuerdo con las directrices institucionales.
- La eutanasia de animales con 200 mg / kg por vía intraperitoneal con pentobarbital / dislocación cervical justo antes de la cosecha del músculo 10. La disección debe ser bien practicado para que el músculo se puede cosechar y montado en el transductor de tensión dentro de los 15 minutos de la eutanasia.
- Organizar cadáver en posición supina en la bandeja de disección de la cara pin a la bandeja.
- Bajo tibial microscopio de disección, la piel abierta, abra cuidadosamente la fascia (Fig. 1A), y la cáscara desde el tobillo hacia arriba para exponer EDL (Fig.1b). Use gotas de solución de Ringer lactato para mantener el músculo húmedo y protegido durante la cosecha.
- Quitar EDL, como la preservación de los tendones de lo posible en cada extremo, y poner en un plato de Petri con solución de Ringer lactato. Lazo de sutura a cada uno de los tendones del músculo (Fig. 1c). Es esencial que las fibras musculares no ser tocado o movido durante la disección.
2. Montaje de la LME del ratón en la Franja de miografía muscular
- Para estos estudios, un baño de tejido que sea necesario que sujeta el músculo, mientras que lo que le permite bañarse en solución fisiológica a temperatura constante con oxigenación continua. El baño es, junto con un transductor de fuerza para la medición de la tensión muscular. Contamos con una banda integrada muscular baño miografía del danés Myo Technology (DMT Modelo 820MS) para este propósito. Además, un estimulador eléctrico pulso cuadrado (modelo Grass S48) y la plataforma de adquisición de datos (ADInstruments PowerLab Sistema de Adquisición de datos y software LabChart) son necesarios para obtener, registrar y analizar mio-mecánico respuestas, respectivamente. La DMT se ha 820MS electrodos de platino integrado en la tapa de la cámara que se colocan a ambos lados del músculo, en la porción media de la tira del músculo. Myographs otros pueden requerir atención específica a la colocación de los electrodos.
- Rellene la cubeta miografía con 5 ml de solución de Krebs Henseleit 11. Calentar a 25 ° C. Burbuja de O 2 / CO 2 (95% / 5%) a través de baño durante 15 minutos antes de su uso.
- Uso de suturas para ampliar EDL entre los bornes de miografía y seguro de los tendones del músculo EDL (Fig.1D, E) entre las abrazaderas. Tenga cuidado de no apretar el propio músculo.
- Mantener baño miografía a 25 ° C.
3. Myo-mecánica Análisis
A. tensión tic
- Ajustar la longitud inicial en el baño por lo que no hay laxitud del músculo.
- Determinar el estímulo máximo (duración 0,5 ms) mediante el ajuste de la tensión con el fin de obtener la tensión máxima de contracción, a continuación, establecer estímulos en un 20% por encima de la máxima (para lograr un estímulo supramáxima). En nuestros estudios, el estímulo supramáxima se logra generalmente en una salida de 40 voltios.
- Compruebe que la salida del estimulador con un osciloscopio.
- Determinar la longitud óptima de forma gradual estirar el músculo hasta que no haya aumento de la tensión nerviosa.
- Permita que los músculos en reposo durante 3 min.
- Ofrecer estímulo supramáxima cuadrados (0,5 m) en longitud óptima con hierba S44 estimulador electrónico, y la producción sin precedentes.
- Registro: contracción curva de tensión (P t frente al tiempo; Fig.2a).
B. tensión contra el tétanos
- Permita que los músculos en reposo durante 3 minutos.
- Aplicar un tren de estímulos supramáxima para 300msec a 150 Hz en condiciones óptimas con hierba S44 estimulador electrónico, y la producción sin precedentes.
- Registro: La curva de tensión contra el tétanos (P o frente al tiempo; Fig.2b).
C. Fuerza de frecuencia
- Permita que los músculos en reposo durante 3 minutos.
- Fuerza-frecuencia: se aplican los trenes de estímulos supra-a los 30, 60, 100, 140 y 160 Hz con 3 minutos de descanso entre cada estímulo (Fig. 3). Por otra parte, los trenes se puede aplicar 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100 140 y 160 Hz para una mejor resolución en frecuencias más bajas, donde los cambios de fuerza de manera sustancial.
- Parcela: fuerza-frecuencia (% frente a la fuerza máxima frecuencia de estimulación).
D. La fatiga
- Aplicar tren de corto tetani: 60 Hz para 300 ms (o frecuencia ajustada para producir el 50% del pico de fuerza), cada 3 segundos durante 10 minutos. A los 10 minutos, la fuerza tetánica debe reducirse a un nivel de la meseta de ~ 15% del valor inicial (Fig. 4).
- Parcela: la fatiga de baja frecuencia (% máximo el tiempo frente a la fuerza).
E. recopilación de datos adicionales al final del protocolo
- Antes de desmontar el músculo de la miografía, establecer el muscle a la longitud óptima según lo determinado en el paso III.A.4 y medir su diámetro utilizando un ocular en el microscopio o con pinzas. Calcular el área transversal (m 2).
- Medir la masa muscular (mg) por la eliminación de puntos de sutura y un peso de músculo.
- Pesar del ratón para evaluar la masa corporal (g).
4. Cálculos
- Músculo: proporción de masa corporal =
la masa muscular / masa corporal - La tensión nerviosa, P t (mN) =
máxima tensión generada durante el movimiento - La tensión nerviosa específica (N / cm 2) =
tensión nerviosa (mN) / área de sección transversal (m 2) x 10 5 N / m 2 • mN / cm 2 - Es hora de pico de tensión (ms) =
tiempo desde el inicio de la contracción a la tensión máxima - Medio tiempo de relajación (ms) =
tiempo de pico de tensión al 50% del pico de tensión - La tensión tetánica, P O (mn) =
máxima tensión generada durante el tétanos - Tensión específica tetánica (N / cm 2) =
tetánica tensión (mN) / área de sección transversal (m 2) x 10 5 N / m 2 • mN / cm 2 - La máxima tasa de aumento del tétanos (N / s) =
tasa máxima de aumento de la tensión durante la subida de tensión en el tétanos, es decir, la pendiente máxima de la curva de tensión tetánica (o, O dP / dt) - De media tensión relajación tetánica (ms) =
tiempo desde el cese de la estimulación en un 50% de la tensión en la terminación de la estimulación - Contracción de tensión a la tensión tetánica relación, P T / P = O
contracción máxima tensión y / o máxima tensión tetánica - = Índice de fatiga
relación de tensión después de dos minutos de la fatiga de baja frecuencia para la tensión isométrica máxima
5. Resultados representante
Figura 1. La disección del músculo EDL. Una exposición, de la extremidad posterior muscles.TA, el tibial anterior. B, la exposición de EDL (extensor largo de los dedos) del músculo. C, la unión de las suturas de tendones EDL. D, baño de tensión del transductor (vista lateral). E, EDL montada en el baño (vista desde arriba). El músculo en forma incompleta inmerso en el buffer con fines ilustrativos, en la práctica, el músculo debe estar completamente sumergido para evitar que se seque.
Figura 2. Ejemplo de curvas de tensión. Un ejemplo, de la curva de contracción tensión que ilustra la tensión de contracción máxima (P t), tiempo de contracción (TC) y el tiempo medio de relajación (HRT). Bar, 1s. B, Ejemplo de la curva de tensión tetánica que muestra la tensión tetánica máxima (P o) y de media tensión relajación tetánica (HRTT). Bar, 1s.
Figura 3. Ejemplo de análisis de la relación fuerza-frecuencia. A las tensiones generadas por las frecuencias de estimulación incremental. B, Ejemplo de tren de pulsos a 30MHz. Bar, 80 ms. C, Ejemplo de tren de pulsos a 140MHz. Bar, 80 ms. D, ejemplo de la curva de fuerza-frecuencia derivada de los datos se muestra en una. La forma de la curva fuerza-frecuencia es característico de la fuerza muscular, y puede ser comparado entre los músculos de diferentes animales.
Figura 4. Ejemplo de análisis de frecuencia de resistencia a la fatiga. A las tensiones, Decremento generados durante un periodo de stimulation.Examples baja frecuencia de los trenes de pulso en los puntos de tiempo indicado (B, C, D) se muestran a continuación. E, Ejemplo de curva de baja frecuencia de la fatiga derivada de los datos se muestra en una. La forma de la curva de frecuencia de la fatiga bajo es característico de la fuerza muscular, y puede ser comparado entre los músculos de diferentes animales.
Discusión
Se describe un enfoque detallado para la evaluación de myo-propiedades mecánicas de los músculos de las extremidades traseras explantados el ratón. La EDL, aunque más difícil de diseccionar, debido a su posición posterior por detrás del músculo tibial anterior, es más fácil de evaluar que el tibial anterior, debido a sus anexos tendinosas prominente en el tobillo y la rodilla. Estos tendones facilitar el montaje en la miografía tira del músculo. Por el contrario, el de más fácil acceso tibial anterior tiene un archivo adjunto amplio, casi atendinous en la articulación de la rodilla, por lo que es sumamente difícil tanto para diseccionar sin comprometer el músculo, y montar de forma segura en la miografía. También señalan que aumentan rápidamente el músculo en un baño de oxigenados en tampón fisiológico y la temperatura es fundamental para conservar las propiedades mecánicas del músculo. Hemos encontrado que podemos repetir este análisis para un máximo de 30 minutos, sin cambios significativos en la respuesta del músculo en estas condiciones. Por último, es esencial que las fibras musculares no se toca durante la disección y los procedimientos de montaje, ya que esto puede tener efectos adversos sobre la función muscular, y el resultado de la subestimación de myo-mecánica de la fuerza. Siguiendo estos procedimientos, el análisis proporciona una aproximación cuantitativa sólida para evaluar los efectos de la modificación genética en la función muscular 6,7,8,9, así como la comparación entre las intervenciones terapéuticas en modelos de ratón de la enfermedad del músculo 1,2,3,5 .
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por un Servicio de Salud Pública Grant (HL086513) del NHLBI para PEO, y una beca de investigación integral en el Instituto de Medicina Regenerativa de California (RC1-00104), un Servicio de Salud Pública Grant (HL085377) del NHLBI, y un regalo de la Fundación Pollin de HSB
SC fue apoyado por un Instituto de California para la Medicina Regenerativa puentes para detener el Premio de Investigación Celular (TB1-01194) de San Francisco State University.
Materiales
Soluciones y los medios de comunicación
Solución de Ringer lactato
- 100 mM NaCl
- 30 mM CH3CH (OH) COONa (lactato de sodio)
- 4 mM KCl
- 1 mM CaCl 2 2H 2 O (cloruro de calcio dihidratado)
- ajustar el pH a 6,75
Krebs Henseleit solución
- 118 mM NaCl
- 4,7 mM KCl
- 1,25 mM CaCl 2
- 1,2 mM de MgCl 2
- 1,2 mM KH 2 PO 4
- 25 mM de NaHCO3
- 11 mM de glucosa
- ajustar el pH a 7,2-7,4 por equilibrar con O 2 / CO 2 (95% / 5%) de gas
Pentobarbital
- 5 mg / ml de solución de trabajo en agua estéril
Referencias
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