En este video se demuestra un protocolo para establecer ratón timo líneas celulares de linfoma. Siguiendo este protocolo, hemos establecido con éxito varias líneas de células T de la ATM-/ - y p53-/ - ratones con linfoma del timo.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Derivación de linfoma tímico líneas de células T de Atm - / - Y P53 - / - Ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
Las líneas celulares establecidas son una herramienta de investigación fundamental que puede reducir el uso de animales de laboratorio en la investigación. Ciertas cepas de ratones genéticamente modificados, tales como ATM - / - y p53 - / - consistentemente desarrollar linfoma del timo primeros años de vida 1,2, y por lo tanto, puede servir como una fuente confiable para la derivación de murino líneas de células T. Aquí presentamos un protocolo detallado para el desarrollo de linfomas tímicos murinos establecido líneas de células T, sin necesidad de añadir las interleucinas como se describe en los protocolos anteriores 1,3. Los tumores se cosecharon de los ratones de tres a seis meses, en la primera indicación de tumores visibles sobre la base de la observación de la postura encorvada, dificultad para respirar, la preparación pobre y perder en un 1,4 cepa susceptible. Hemos establecido con éxito varias líneas de células T que utilizan este protocolo y cepas puras de ATM - / - [FVB/N- Atm tm1Led / J] 2 y p53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 ratones. Además, demuestran que más del 90% de lo establecido población de células T expresa CD3, CD4 y CD8. De acuerdo con las líneas celulares establecidas de forma estable, las células T generados por el uso del presente Protocolo se han pases para más de un año.
Protocolo
1. La disección del tumor
- Para la disección del tumor, una toalla de papel o paño quirúrgico desechable se coloca en la plataforma de la disección y rociado con etanol al 70%.
- Los ratones de este protocolo son habitualmente sacrificados con CO 2. Coloque el ratón sacrificados en la plataforma de la disección y el spray ambos lados del animal con etanol. El ratón se mantiene en su lugar en la almohadilla de la disección a través de cuatro o más alfileres inserta a través de las piernas y los roció abundantemente con etanol al 70%.
- La piel que cubre la línea media se corta desde el pubis hasta la base de la cabeza con unas tije....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
En este protocolo, se proporcionan procedimientos detallados para establecer murino líneas de células T a partir de dos genotipos diferentes del ratón, ATM - / - [FVB/N- Atm tm1Led / J] y p53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . Mediante el uso de este protocolo, un total de 6 (de 7 intentos) ATM - / - y tres (de 5 intentos) p53 - / - murino líneas de células T se han establecido en nuestro laboratorio. .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Dr. Boris Reizis del Departamento de Microbiología e Inmunología en la Universidad de Columbia útil para los debates. También queremos agradecer a la Dra. Margaret Bynoe, Dr. Rodman Getchell y Mahamed Deequa del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Cornell para la asistencia técnica con la citometría de flujo y Lu Huang para obtener ayuda con la edición de vídeo. Los autores también desean agradecer a los miembros de Duhamel y los laboratorios de Weiss para su revisión crítica de la producción de manuscritos y de vídeo, y Yazinski Stephanie Weiss en el laboratorio de re....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
- Ramo de hielo
- 70% de etanol
- Disección de plataforma que consta de bloques de espuma cubierta con papel de aluminio y pasadores
- Dos conjuntos de pequeñas tijeras y pinzas estériles
- Estéril de 150 mm 2 placa de Petri (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA;. Cat # 08-757-13)
- Estéril 18 agujas de calibre
- 50 ml tubos cónicos (Corning Inc., Corning NY, cat # 430829)
- 10% de formol
- Frascos de cultivo de tejidos
- T-25 (TPP, Trasadingen, Suiza, cat # 90025)
- T-75 (TPP, Trasadingen, Suiza, cat # 90075)
- Placas de 6 pocillos (Corning Inc., Corning NY, cat # 3506)
- Estéril tamponada con fosfato salino pH 7.2 (PBS)
- Medio de cultivo
- RPMI 1640 con HEPES 25 mM, 200 mM L-glutamina (Lonza, Walkersville, MD, cat # 12-115F), complementado con lo siguiente:
- 10% inactivado por calor (56 ° C, 30 min) de suero fetal bovino (SFB; Hyclone, Logan, UT, cat # SH30088.03)
- 1% de penicilina y estreptomicina (Mediatech, Manassas, VA; gato # 30-002-CI)
- 1% aminoácidos no esenciales (Mediatech, cat # 25-025-CI)
- 55 mM 2β-mercaptoetanol (Sigma, St Louis, MO, cat # M752)
- RPMI 1640 con HEPES 25 mM, 200 mM L-glutamina (Lonza, Walkersville, MD, cat # 12-115F), complementado con lo siguiente:
- Dimetilsulfóxido (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA, cat # 317275)
- Anticuerpos (eBioscience, San Diego, CA)
- anti-CD3-FITC (cat. # 11-0031-85)
- anti-CD4-APC (cat. # 17-0041-83)
- anti-CD8-PE (cat. # 12-081-85)
- Albúmina sérica bovina (BSA, Life Technologies, Grand Island, NY;. Cat # 11018-017)
- Concanavalina A (Sigma cat # C5275)
- 1,8 mL viales de congelación (Nunc, Roskilde, Dinamarca, cat # 368632)
Referencias
- Barlow, C. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86, 159-171 (1996).
- Elson, A. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).
- Kuang, X.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
