La ingeniería biológica basada en los injertos vasculares El uso de un biorreactor pulsátil

Summary

Nuestro grupo ha desarrollado un sistema de cultivo bio-reactor que imita el estrés pulsátil fisiológicos del sistema cardiovascular para regenerar implantables de pequeño diámetro injertos vasculares.

Abstract

Mucho esfuerzo se ha dedicado a desarrollar y fomentar la metodología de regeneración funcional de pequeño diámetro arterial pasa por alto. En el medio fisiológico, tanto la estimulación mecánica y química están obligados a mantener el adecuado desarrollo y la funcionalidad de ^1,2 vasos arteriales.

Sistemas de biorreactor de la cultura desarrollada por nuestro grupo están diseñados para apoyar la regeneración de vasos dentro de un control preciso quimio-mecánica entorno imitando la de los vasos nativos. Nuestra asamblea biorreactor y procedimientos de mantenimiento son bastante simples y altamente repetible ^3,4. Las células musculares lisas (SMC) se siembran en un ácido poliglicólico tubular (PGA) de malla que se coloca en un tubo de silicona compatible y cultivadas en el biorreactor con o sin estimulación pulsátil de hasta 12 semanas. Hay cuatro características principales que distinguen a nuestro biorreactor de algunos predecesores. 1) A diferencia de otros sistemas de cultivo que simulan sólo la bioquímica de los vasos sanguíneos circundantes nativo, nuestro biorreactor también crea un ambiente pulsátil fisiológico mediante la aplicación de la tensión radial cíclico de los vasos en la cultura. 2) Varios barcos de ingeniería pueden ser cultivadas simultáneamente bajo diferentes condiciones mecánicas en un entorno químicas controladas. 3) El biorreactor permite una monocapa de células endoteliales (CE) para ser fácilmente cubierta en el lado luminal de los vasos diseñados para los modelos de implantación de los animales. 4) El biorreactor puede recipientes de cultivo diseñado con un tamaño diferente diámetro osciló entre 1 mm y 3 mm, ahorrando el esfuerzo de adaptar cada biorreactor individuales para ajustarse a un tamaño de diámetro específico.

Los vasos de ingeniería cultivadas en nuestro biorreactor se asemejan a los vasos nativos sangre histológicamente en algún grado. Las células de la pared de los vasos maduros expresan marcadores de SMC contráctiles del músculo liso, como la cadena pesada de miosina (SMMHC) ^3. Una cantidad sustancial de colágeno se deposita dentro de la matriz extracelular, que es responsable de la resistencia a la rotura mecánica de los vasos de ingeniería ^5. El análisis bioquímico también indica que el contenido de colágeno de los vasos de ingeniería es comparable a la de las arterias nativas ^6. Es importante destacar que el biorreactor pulsátil siempre ha regenerado los vasos que muestran propiedades mecánicas que permiten la implantación de experiencias exitosas en modelos animales ^3,7. Además, este biorreactor se pueden modificar para permitir la evaluación en tiempo real y el seguimiento de la remodelación del colágeno a través del tiempo, de forma no invasiva, utilizando un microscopio óptico no lineal (NLOM) ^8. Para concluir, este biorreactor debe servir como una plataforma excelente para el estudio de los mecanismos fundamentales que regulan la regeneración funcional de pequeño diámetro injertos vasculares.

Protocol

Autoclave

Ensamble y autoclave los tubos del sistema de caudal y componentes bio-reactor (biorreactor sí mismo y la tapa de silicona tapón) como se indica en la Figura 1 y Figura 2. Alimentación por sonda tiene un conector macho en un extremo y un extremo abierto en el otro lado. Tres segmentos de tubo corto se inserta a través de una gorra de silicona para el intercambio de gases.

1. Coser PGA Mesh

1. Corte de malla de 1,1 cm PGA ~ x 8 cm hoja (depende del tamaño del biorreactor).
2. Limpie el tubo de silicona (diámetro interior de 3 mm) con agua destilada (dH20) y secar al aire antes de su uso. <....

Discussion

La calidad de los buques de ingeniería es en gran parte dictadas por la calidad de la SMC utilizados en el cultivo de tejidos. Los aspectos críticos del fenotipo contráctil SMC incluyen la morfología, el número de paso bajo, y la capacidad de proliferar en el interior del biorreactor. Se recomienda que el número de pases no será superior a P3 en el momento de la siembra de células en el andamiaje de polímero. Por otra parte, es crucial para confirmar que las fuentes de SMC son libres de micoplasma antes de su uso. Hemos.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / Material	Proveedor	Número de catálogo
FBS (suero fetal bovino) inactivado por calor	HyClone	SH30071
DMEM	GIBCO	11885
rhFGF-básica	R & B	234-FSE
rrPDGF-BB	R & B	520-BB
Penicilina G	Sigma	PENNA
De cobre (II) sulfato	Sigma	C8027
Gylcine	Sigma	C8790
L-alanina	Sigma	A7469-25G
L-prolina	Sigma	P5607-25G
Ácido Ascórbico	Sigma	A4544-25G
HEPES	Sigma	H3375-100G
Tapón de silicona	Cole-Parmer	06298-24
Masterflex tubos L / S	Cole-Parmer	06508-16, 06508-18
Masterflex bomba	Cole-Parmer	7553-80
Dacron manguito	Maquet	174406
PGA se sintió	Concordia	MO000877-01
4-0 1.5 métricas Surgipro II sutura	Syneture	VP-557-X
6-0 0.7 sutura Dexon métricas	Syneture	7538-11
0.22μm PTFE filtros	Whatman	6780-2502
Three Way llave de paso	Edwards Lifesciences	593WSC
Transductor de presión	Edwards Lifesciences	PX212
IV bolsas	Baxter	R4R2110
Conjunto de dilución salina	Flecha	W20030
Tubo de silicona	Saint-Gobain	F05027