Este protocolo esboza una manera de etiquetar y rastrear el destino de los pequeños grupos de células de embriones de pez cebra empleando la radiación UV-uncaging de fluoresceína enjaulado, seguido de monte se inmunomarcaje para amplificar la señal de la fluoresceína uncaged.
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Artículo de método
Etiquetado linaje de células de pez cebra con láser Uncagable fluoresceína Dextran
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Resumen
Resumen
Un problema central en la biología del desarrollo es deducir el origen de la miríada de tipos de células presentes en los vertebrados que se presenten a partir de precursores indiferenciados. Los investigadores han utilizado diversos mecanismos de etiquetado linaje, como DII etiquetado y una presión de inyección de enzimas trazabilidad de 2 a determinar el destino celular en etapas posteriores del desarrollo de los sistemas modelo. Los mapas de destino por primera vez en el pez cebra (Danio rerio) se reunieron por inyección iontoforética de los tintes fluorescentes, tales como rodamina dextrano, en células individuales en regiones discretas del embrión y el seguimiento de la suerte de la celda marcada con el tiempo 5.3. Si bien es efectivo, estos métodos son técnicamente exigentes y requieren equipo especializado no se encuentran comúnmente en los laboratorios de pez cebra. Recientemente, photoconvertable proteínas fluorescentes, como el Eos y Kaede, que irreversiblemente cambia de verde a rojo cuando la fluorescencia expuestos a la luz ultravioleta, estamos viendo un mayor uso en el pez cebra 6-8. La claridad óptica del embrión de pez cebra y la relativa facilidad de la transgénesis ha hecho estas herramientas especialmente atractiva para el etiquetado de linaje y de observar la migración de las células in vivo 7. A pesar de su utilidad, estas proteínas tienen algunas desventajas en comparación con el tinte mediada por los métodos de etiquetado linaje. La más crucial es la dificultad que hemos encontrado en la obtención de 3-D de alta resolución durante fotoconversión de estas proteínas. En este sentido, tal vez la mejor combinación de resolución y facilidad de uso para el etiquetado de linaje en el pez cebra hace uso de jaulas con fluoresceína dextrano, un tinte fluorescente que se une a un grupo de enfriamiento que enmascara su fluorescencia 9. El medio de contraste puede ser "Uncaged" (lanzado desde el grupo de extinción) dentro de una célula específica mediante la luz ultravioleta de una lámpara de láser o de mercurio, lo que permite la visualización de la fluorescencia o la inmunodetección. A diferencia de los métodos de iontoforesis, fluoresceína enjaulados puede ser inyectado con aparatos de inyección estándar y uncaged con un microscopio de epifluorescencia equipado con un orificio 10. Además, los anticuerpos contra la fluoresceína detectar sólo la forma uncaged, y el epítopo sobrevive la fijación y 11. Por último, la fluoresceína enjaulados puede ser activado con muy alta resolución 3-D, sobre todo si la microscopia de dos fotones se emplea 12,13. Este protocolo describe un método de etiquetado linaje de fluoresceína enjaulados y uncaging láser. Subsequenctly, uncaged fluoresceína se detecta de forma simultánea con otros epítopos, como las buenas prácticas agrarias, mediante el etiquetado con anticuerpos.
Protocolo
1. Síntesis de la jaula con fluoresceína Dextran
- Mida 3,5 a 4 mg de aminodextrano y añadir en el tubo de color Invitrogen suministrado con 1 mg de CMNB-jaula SE fluoresceína. En nuestras manos esta relación da una carga promedio de ~ 2,5 moléculas de colorante por dextrano.
- Añadir 500 l de 0,1 M Na 2 B 4 O 7 buffer (borato de sodio) en el tubo.
- El tapón y mezclar por 30 segundos para disolver el aminodextrano fluoresceína y enjaulado.
- Vamos a reaccionar durante la noche en un mezclador vórtex.
- Desenrosque el cierre inferior de una columna de centrifugación Zeba y aflojar la tapa. Marc....
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Discusión
Como se ha descrito, este protocolo ofrece un método de etiquetado linaje relativamente rápido en el pez cebra que se basa en las técnicas de uso de la microinyección, la microscopía e inmunofluorescencia. Hemos encontrado que el láser uncaging ser la manera más eficiente y rentable para desenjaular fluoresceína de forma localizada. Este método podría ser utilizado para etiquetar linaje con criterios de valoración experimental tan tarde como 4 dpf. Sin embargo, como se dividen las células, la concentración de jaula con .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Dan Carlin para ayudar en la toma de fluoresceína enjaulado. Además nos gustaría agradecer a las fuentes de financiación: Universidad de Vanderbilt Programa Escuela de Medicina de Subvención de Desarrollo de Capacitación de Biología de JAC, y NIH HD054534to JTG.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| CMNB-fluoresceína SE protegida | Invitrogen | C20050 | |
| Aminodextrana, 10 kDa | Invitrogen | D1860 | |
| Columnas desalificadoras centrífugas Zeba | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| anticuerpo de cabra antifluoresceína | Invitrogen | A11095 | |
| anticuerpo donkey anti-cabra Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A21082 | |
| placas de Petri de 35 mm × 10 mm | BD Biosciences | 351008 | |
| microscopio compuesto vertical con objetivo de inmersión en agua de 40x | Leica Microsystems | DM6000B | |
| Sistema manual de iluminación láser MicroPoint | Photonic Instruments | ||
| Feniltiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | |
| Tricaina | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Proteinasa K | Roche Group | 03115836991 | |
| Hilo plástico | Cualquier proveedor | ||
| Agarosa | Research Products International Corp. | A20090 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Savant SPD131DDA | |
| mezclador vortex | VWR international | Vortex Genie 2 | |
| inyector de presión | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
Referencias
- Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
- Wetts, R., Fraser, S. E.
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran
Posted by JoVE Editors on 5/25/2011. Citeable Link.
A correction was made to Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to:
Ilya A. Shestopalov and James K. Chen
instead of:
Ilya Shestopalov and James Chen
