Etiquetado linaje de células de pez cebra con láser Uncagable fluoresceína Dextran

Resumen

Este protocolo esboza una manera de etiquetar y rastrear el destino de los pequeños grupos de células de embriones de pez cebra empleando la radiación UV-uncaging de fluoresceína enjaulado, seguido de monte se inmunomarcaje para amplificar la señal de la fluoresceína uncaged.

Resumen

Un problema central en la biología del desarrollo es deducir el origen de la miríada de tipos de células presentes en los vertebrados que se presenten a partir de precursores indiferenciados. Los investigadores han utilizado diversos mecanismos de etiquetado linaje, como DII etiquetado y ^una presión de inyección de enzimas trazabilidad de ² a determinar el destino celular en etapas posteriores del desarrollo de los sistemas modelo. Los mapas de destino por primera vez en el pez cebra (Danio rerio) se reunieron por inyección iontoforética de los tintes fluorescentes, tales como rodamina dextrano, en células individuales en regiones discretas del embrión y el seguimiento de la suerte de la celda marcada con el tiempo ^5.3. Si bien es efectivo, estos métodos son técnicamente exigentes y requieren equipo especializado no se encuentran comúnmente en los laboratorios de pez cebra. Recientemente, photoconvertable proteínas fluorescentes, como el Eos y Kaede, que irreversiblemente cambia de verde a rojo cuando la fluorescencia expuestos a la luz ultravioleta, estamos viendo un mayor uso en el pez cebra ^6-8. La claridad óptica del embrión de pez cebra y la relativa facilidad de la transgénesis ha hecho estas herramientas especialmente atractiva para el etiquetado de linaje y de observar la migración de las células in vivo ^7. A pesar de su utilidad, estas proteínas tienen algunas desventajas en comparación con el tinte mediada por los métodos de etiquetado linaje. La más crucial es la dificultad que hemos encontrado en la obtención de 3-D de alta resolución durante fotoconversión de estas proteínas. En este sentido, tal vez la mejor combinación de resolución y facilidad de uso para el etiquetado de linaje en el pez cebra hace uso de jaulas con fluoresceína dextrano, un tinte fluorescente que se une a un grupo de enfriamiento que enmascara su fluorescencia ^9. El medio de contraste puede ser "Uncaged" (lanzado desde el grupo de extinción) dentro de una célula específica mediante la luz ultravioleta de una lámpara de láser o de mercurio, lo que permite la visualización de la fluorescencia o la inmunodetección. A diferencia de los métodos de iontoforesis, fluoresceína enjaulados puede ser inyectado con aparatos de inyección estándar y uncaged con un microscopio de epifluorescencia equipado con un orificio ^10. Además, los anticuerpos contra la fluoresceína detectar sólo la forma uncaged, y el epítopo sobrevive la fijación y ^11. Por último, la fluoresceína enjaulados puede ser activado con muy alta resolución 3-D, sobre todo si la microscopia de dos fotones se emplea ^12,13. Este protocolo describe un método de etiquetado linaje de fluoresceína enjaulados y uncaging láser. Subsequenctly, uncaged fluoresceína se detecta de forma simultánea con otros epítopos, como las buenas prácticas agrarias, mediante el etiquetado con anticuerpos.

Protocolo

1. Síntesis de la jaula con fluoresceína Dextran

1. Mida 3,5 a 4 mg de aminodextrano y añadir en el tubo de color Invitrogen suministrado con 1 mg de CMNB-jaula SE fluoresceína. En nuestras manos esta relación da una carga promedio de ~ 2,5 moléculas de colorante por dextrano.
2. Añadir 500 l de 0,1 M Na ₂ B ₄ O ₇ buffer (borato de sodio) en el tubo.
3. El tapón y mezclar por 30 segundos para disolver el aminodextrano fluoresceína y enjaulado.
4. Vamos a reaccionar durante la noche en un mezclador vórtex.
5. Desenrosque el cierre inferior de una columna de centrifugación Zeba y aflojar la tapa. Marca un punto en la columna con un rotulador. Colocar la columna en un tubo cónico de 15 ml.
6. Centrifugar a 1000 xg durante 2 minutos con el punto frente al centro del rotor. Use la columna inmediatamente después de la compactación.
7. Colocar la columna compacta en una nueva de 15 ml tubo cónico.
8. Piscina mezcla de reacción y traslado al centro de la cama columna de resina compacta. Reemplace la tapa.
9. Centrifugar a 1000 xg durante 2 minutos con el punto frente al centro del rotor. Después de la vuelta, el eluyente y la parte superior de la columna será más o menos el mismo tono de color amarillo.
10. Transferir el eluyente amarillo (~ 350 l) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
11. Liofilizar hasta sequedad en un speedvac. Cubrir el speedvac con papel de aluminio.
12. Vuelva a suspender el resultado ~ 3.2 mg de espuma de color amarillo pálido en el agua a una concentración final de 1% w / v.
13. Almacenar esta solución a -20 ° C en papel de aluminio cubierto de tubos. Es una buena idea alícuota de la solución de dextrano para prevenir la repetición de congelación-descongelación.

2. La inyección de fluoresceína Caged Dextran en embriones de pez cebra

1. Diluir 1% w / v stock de jaulas 01:05 fluoresceína dextrano o 1:10 en KCl 0,2 M.
2. Inyectar 0,5 - 1.0nL de la solución de fluoresceína enjaulados en la yema de un embrión de células etapa con una presión de inyección. Una vez inyectado, garras de embriones debe ser mantenido en la oscuridad a 28,5 ° C para reducir no específicos uncaging.
3. Eliminar manualmente coriones a partir de embriones.
4. Anestesiar a los embriones en el 4% tricaína.
5. Los embriones se montará en el 0,8% de agarosa en 35mmx10mm placa de Petri, luego se cubre con agua de huevo.
6. Equilibre agarosa derretida en el 50 del bloque de calor ° C durante al menos 15 minutos.
7. Con una pipeta de vidrio, elaboración de un embrión en una cantidad mínima de agua y la liberan en la agarosa. Nota: Es importante que se enfríe el tubo de agarosa en la mano durante aproximadamente 30 segundos antes de colocar el embrión en el tubo para evitar matar al embrión.
8. Pipeta el embrión de la trompa, junto con aproximadamente 50μL de agarosa y expulsar el contenido en el centro de la placa de Petri.
9. Orientar rápidamente el embrión utilizando un hilo de plástico con las células que se uncaged hacia arriba. Nota: La agarosa se ​​enfrían rápidamente para ser precipitada con la orientación del embrión. Los embriones se pueden dañar si se manipula después de la agarosa se vuelve rígido.
10. Deje que la agarosa para solidificar completamente (esto tarda unos minutos) y llenar el recipiente con dos tercios del agua de huevo contiene un 4% y 0,003% tricaína PTU.

3. Laser uncaging de fluoresceína Dextran

1. El microscopio usado para uncaging debe tener un objetivo de inmersión en agua 40 veces.
2. Utilizamos un Fotónica Instrumentos láser con la célula nm tinte 365 y el 70% / 30% se reparte espejo dicroico.
3. Antes de uncaging, el láser se debe hacer parfocal con el objetivo y atenuada a la alimentación adecuada.
4. Para enfocar el láser, colocar una lámina de vidrio reflejado en el objetivo y el enfoque del objetivo hasta que los arañazos en la diapositiva son visibles.
5. Ajuste del atenuador de láser hasta que el láser puede producir un rasguño claramente visible en el espejo con un solo pulso.
6. Ajustar el enfoque objetivo hacia arriba y abajo. Si el láser puede producir un cero cuando el objetivo está fuera de foco, ajuste el enfoque de láser de ¼ de vuelta hacia arriba o hacia abajo. Repita hasta que el láser puede rayar el espejo sólo cuando el objetivo se centra.
7. Lugar montado embrión en el objetivo y se centran en el área que se uncaged.
8. Para desenjaular, se centran en una célula de interés y el pulso es 10-20 veces menos 2-3 Hz.
9. Después de uncaging, sin el embrión mediante el peeling de agarosa de distancia con unas pinzas y poniéndolas en agua que contienen huevo PTU 0,003%. Deje que se desarrollan los embriones en una caja opaca a la luz hasta que se fija.

4. Anticuerpo etiquetado y detección de Uncaged Dextran con fluoresceína

1. Fix embriones en Ab fijador (4% de paraformaldehído, 0,3 CaCl _2, 8% de sacarosa, fosfato 1X buffer de pH de solución salina, 7.3) de dos a cuatro horas a temperatura ambiente (RT) o durante la noche (O / N) a 4 ° C. Mantener los embriones en una caja de luz o un tubo estrecho envueltas en papel aluminio para todas las medidas de etiquetado.
2. Retire el fijador y reemplazar con el 100% de MeOH, dejar durante 10 minutos a temperatura ambiente, eliminar MeOH y reemce con MeOH frescas 100%.
3. Tienda en MeOH a -20 ° C durante al menos 30 minutos. Nota: Es posible almacenar en MeOH para un máximo de dos semanas antes de epítopos comienzan a degradarse.
4. Rehidratar embriones con 5 lavados minutos a temperatura ambiente de 75% de fosfato MeOH/1X solución salina tamponada con Tween 20 al 0,1% (1X PBSTw), entonces 1XPBTw 50% MeOH/50%, entonces el 25% MeOH/75% 1X PBSTw.
5. Lavar tres veces durante 5 minutos en 1XPBSTw.
6. Si los embriones son> 24 horas de vida, permiabilize embriones con 10 mg / ml de proteinasa K en 1XPBSTw. Permiabilization tiempo depende de la etapa. Cinco minutos en proteinasa K es suficiente si los embriones tienen entre 24 y 48 horas posteriores a la fecundación (HPF). Más tiempo puede ser necesario si las larvas de la tercera edad. Volver a fijar en Ab fijador durante 20 minutos a temperatura ambiente
7. Lavar cinco veces durante 5 minutos en 1XPBSTw a temperatura ambiente.
8. Incubar en la solución de bloqueo (1XPBS, 0,1% Triton X100, el 10% suero de oveja, 10% de albúmina de suero bovino, 1% de dimetilsulfóxido) durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
9. Diluir anticuerpos primarios (anti-fluoresceína además de anticuerpos contra el tipo de célula-marcadores específicos) en solución de bloqueo.
10. Embriones se incuban O / N a 4 ° C en una solución que contiene anticuerpos primarios.
11. Lavar cuatro veces durante 20 minutos en solución salina tamponada con 1XPhosphate Triton x100 0,1% (PBSTx) a temperatura ambiente.
12. Diluir anticuerpos marcados con fluorescencia secundaria (por lo general 1:300) en solución de bloqueo.
13. Incubar O / N a 4 ° C en una solución que contiene anticuerpos secundarios.
14. Lavar cuatro veces durante 20 minutos en 1XPBSTx a temperatura ambiente.
15. Embriones claro en 1XPBS 50% glycerol/50% por lo menos dos horas a temperatura ambiente, luego retire el glicerol / PBS mezcla y se añaden 100% de glicerol y se deja reposar O / N a 4 ° C.

5. Los resultados representativos:

Después de inmunomarcación, debe haber una zona enriquecida de la tinción de las células que se uncaged (Figure.1). No es raro ver una señal relativamente alta proporción de ruido en> el pez cebra de 48 horas de edad, debido a uncaging espontánea de la fluoresceína.

Figura 1. Etiquetado linaje de peces cebra complejo pineal. A las 24 HPF, una porción de la glándula pineal esbozo anterior, indica foxd3:. Expresión GFP, se uncaged utilizando pulsos de láser UV A) Por 48hpf, un grupo en el lado izquierdo de células llamadas parapineal (círculo rojo) ha surgido de la uncaged dominio (círculo blanco). B) Uncaged señal de fluoresceína se enriquece en el parapineal (círculo rojo) y el órgano pineal (círculo blanco).

Discusión

Como se ha descrito, este protocolo ofrece un método de etiquetado linaje relativamente rápido en el pez cebra que se basa en las técnicas de uso de la microinyección, la microscopía e inmunofluorescencia. Hemos encontrado que el láser uncaging ser la manera más eficiente y rentable para desenjaular fluoresceína de forma localizada. Este método podría ser utilizado para etiquetar linaje con criterios de valoración experimental tan tarde como 4 dpf. Sin embargo, como se dividen las células, la concentración de jaula con ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CMNB-fluoresceína SE protegida	Invitrogen	C20050
Aminodextrana, 10 kDa	Invitrogen	D1860
Columnas desalificadoras centrífugas Zeba	Pierce, Thermo Scientific	89889
anticuerpo de cabra antifluoresceína	Invitrogen	A11095
anticuerpo donkey anti-cabra Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21082
placas de Petri de 35 mm × 10 mm	BD Biosciences	351008
microscopio compuesto vertical con objetivo de inmersión en agua de 40x	Leica Microsystems	DM6000B
Sistema manual de iluminación láser MicroPoint	Photonic Instruments
Feniltiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaina	Sigma-Aldrich	E10521
Proteinasa K	Roche Group	03115836991
Hilo plástico	Cualquier proveedor
Agarosa	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
mezclador vortex	VWR international	Vortex Genie 2
inyector de presión	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3