Siete pasos para células estrelladas

Resumen

Aquí se describe un método para el aislamiento de las células estrelladas hepáticas del hígado de ratón. Para la purificación de células estrelladas, hígados de los ratones se digieren In situ Y In vitro Por el tratamiento pronasa colagenasa antes de la centrifugación en gradiente de densidad. Esta técnica produce células hepáticas estrelladas de alta pureza.

Resumen

Las células estrelladas hepáticas son residentes del hígado de las células de la estrella-como la morfología y se encuentran en el espacio de Disse entre el hígado y las células endoteliales sinusoidales ^1,2 hepatocitos. Las células estrelladas se derivan de los precursores de la médula ósea y almacenar hasta 80% de la vitamina A del cuerpo total de ^{1, 2.} Tras la activación, las células estrelladas se diferencian en miofibroblastos para producir la matriz extracelular, contribuyendo así a la fibrosis del hígado ^3. Con base en su capacidad para contratar, las células estrelladas miofibroblástico puede regular el tono vascular asociado a la hipertensión portal ^4. Recientemente, hemos demostrado que las células estrelladas hepáticas son potentes células presentadoras de antígeno y puede activar las células NKT, así como los linfocitos T convencionales ^5.

Aquí presentamos un método para la preparación eficaz de las células estrelladas hepáticas del hígado de ratón. Debido a su localización perisinusoidal, el aislamiento de las células estrelladas hepáticas es un proceso de múltiples pasos. A fin de que las células estrelladas accesible para el aislamiento del espacio de Disse, hígados de los ratones son perfundidos in situ con el Pronasa digestivo E enzimas colagenasa y la perfusión P. Después, el tejido hepático se somete a tratamiento enzimático adicional con pronasa E y P en la colagenasa vitro. Posteriormente, el método se aprovecha de la enorme cantidad de gotas de vitamina A de lípidos que almacena en las células estrelladas hepáticas. Esta característica permite la separación de las células estrelladas hepáticas de otros tipos de células por centrifugación en un 8% de pendiente Nycodenz. El protocolo descrito aquí produce una población muy pura y homogénea de las células estrelladas. Pureza de las preparaciones pueden ser evaluados mediante la tinción de la molécula de proteína glial fibrilar marcador ácida (GFAP), previo al análisis por microscopía de fluorescencia o citometría de flujo. Además, la microscopía de luz revela el aspecto único de la forma de estrella, las células estrelladas hepáticas que albergan grandes cantidades de gotitas de lípidos.

En conjunto, se presenta un protocolo detallado para el aislamiento eficiente de las células estrelladas hepáticas, incluyendo imágenes representativas de su aspecto morfológico y la expresión de GFAP que ayudan a definir la entidad de células estrelladas.

Protocolo

Ratones C57BL / 6 se debe utilizar en aproximadamente 20 semanas de edad o más. El uso de ratones macho de 25 a 30 g se recomienda. El rendimiento de las células estrelladas se puede aumentar por la alimentación de los ratones de la vitamina A dieta enriquecida por 2 meses antes de que el aislamiento de células estrelladas. Aproximadamente 2x10 ⁵ células estrelladas hepáticas pueden purificar a partir del hígado de un C57BL / 6 del ratón, mientras que el rendimiento de las células estrelladas de ratones Balb / c es mucho mayor. El siguiente protocolo se ajusta a 5 ratones. Cuidado de los animales y la experimentación se realizaron de acuerdo con el cuidado....

Discusión

Las células estrelladas hepáticas regular esenciales los procesos fisiológicos y fisiopatológicos en el hígado. Por otra parte, las células estrelladas poseen propiedades presentadoras de antígeno, lo que hace que un componente importante de la respuesta inmune hepática. Aunque las células estrelladas hepáticas constituyen el 10-15% del número total de células en el hígado, el aislamiento de estas células es un reto debido a su localización en el espacio perisinusoidal de Disse.

Aquí present.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	N º de catálogo
70μm de células colador	BD	352350
CACL 2 x 2 H 2 O	Sigma-Aldrich	C3306
Colagenasa P	Roche	11249002001
DMEM	Gibco	11960
DNasa I	Roche	10104159001
DPBS	Cellgro	21 a 031-cv
EGTA	Fluka	3777
De suero fetal bovino	Gibco	16000
Glucosa	Sigma-Aldrich	G7528
Los tubos de centrifugación de gradiente	Greiner Bio-One	163160
HEPES	Gibco	15630
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
KH 2 PO 4	Sigma-Aldrich	P9791
L-Glutamina	Gibco	25030
MgCl2 x 6H 2 O	Fluka	63068
MgSO 4 x 7H 2 O	Sigma-Aldrich	M2773
Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O	Fluka	71643
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaH 2 PO 4 x H 2 O	Fluka	71507
NaHCO3	Fluka	71628
Nycodenz	Accudenz AG	AN7050/BLK
Penicilina / estreptomicina	Gibco	15140
Bomba peristáltica	Cole Parmer	HV-7523-70
Rojo fenol	Sigma-Aldrich	P4633
Pronasa E	Calbiochem	7433-2
Tubo de silicona	Masterflex	HV-96.440-14
El piruvato de sodio	Gibco	11360
Frasco de cultivo de tejidos (25 cm 2)	BD	353108
Equipo de infusión con alas	Terumo	1SV27EL