Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Resumen

Se describe un método simple, rápido de generación de 3D, como los tejidos esferoides y su potencial aplicación para cuantificar las diferencias en las interacciones célula-célula.

Resumen

Los estudios de la cohesión célula-célula y la adhesión célula-sustrato históricamente han llevado a cabo en cultivos de monocapa adherida a sustratos rígidos. Las células en un tejido, sin embargo, suelen ser encerrado dentro de una masa de tejido muy juntos en el cual las células establecer conexiones íntimas con muchos casi vecinos y con componentes de la matriz extracelular. En consecuencia, el entorno químico y físico experimentado por las fuerzas de las células en un tejido 3D son fundamentalmente diferentes de las experimentadas por las células cultivadas en cultivo en monocapa. Esto se ha demostrado que el impacto notablemente la morfología celular y la señalización. Varios métodos han sido diseñados para generar culturas de células en 3D incluyendo encapsulación de células en geles de colágeno o ^un biomaterial en andamios ^2. Estos métodos, aunque útiles, no recapitulan la íntima directa célula-célula arquitectura de adhesión se encuentra en los tejidos normales. Por el contrario, más de cerca los sistemas de aproximación de la cultura en la que las células individuales están más o menos dispersas dentro de una malla 3D de productos de ECM. Aquí se describe un método simple en el cual las células se colocan en la cultura colgantes caída y se incubaron en condiciones fisiológicas, hasta que la verdadera forma de esferoides 3D en el que las células están en contacto directo con ellos y con componentes de la matriz extracelular. El método no requiere equipo especializado y puede ser adaptado para incluir la adición de cualquier agente biológico en cantidades muy pequeñas que pueden ser de interés en el esclarecimiento de los efectos en la célula-célula o la interacción célula-ECM. El método también puede utilizarse para el co-cultivo de dos (o más) de diferentes poblaciones de células con el fin de dilucidar el papel de las interacciones célula-célula o célula-ECM en la especificación de las relaciones espaciales entre las células. Célula-célula la cohesión y la adhesión célula-ECM son los pilares de los estudios de desarrollo embrionario, la interacción, las células tumorales del estroma en la invasión maligna, la cicatrización de heridas, y para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Este sencillo método proporcionará un medio de generar tejido como agregados celulares para la medición de las propiedades biomecánicas o para el análisis molecular y bioquímico en un modelo fisiológicamente relevantes.

Protocolo

1. Preparación de una suspensión de células individuales

1. Adherente culturas de células deben ser cultivadas a 90% de confluencia, las monocapas con lo cual se deben enjuagar dos veces con PBS. Después de drenar bien, añadir 2 ml (para placas de 100 mm) de la tripsina-1 0.05% mM EDTA y se incuba a 37 ° C hasta que las células separar. Dejar de tripsinización mediante la adición de 2 ml de medio completo y con cuidado el uso de una pipeta de 5 ml para triturar la mezcla hasta que las células están en suspensión. La transferencia de células a un tubo cónico de 15 ml.
2. Añadir 40 ml de un 10 acciones mg / ml DNAsa e incubar durante 5 minutos a temperat....

Discusión

Los estudios han demostrado que el cultivo de células en un contexto de tres dimensiones (3D) produce la morfología celular y la señalización distinta en comparación con un rígido de dos dimensiones del sistema de cultivo (2D) ^9. Por ejemplo, poblada de fibroblastos-geles de colágeno demostrar que la morfología de fibroblastos en 3D es muy distinta de la observada en 2D ^10,11. Del mismo modo, la cultura 3D puede inducir la diferenciación de tejidos específicos de las células epiteliales mamarias. L.......

Materiales