Summary
وصفنا بسيطة ، طريقة سريعة لتوليد أنسجة 3D مثل الأجسام الشبه الكروية وإمكانية تطبيقها لقياس الاختلافات في خلية خلية التفاعلات.
Abstract
تاريخيا دراسات خلية خلية والتلاحم ، والتصاق الخلايا التحتية التي أجريت على الثقافات المونولاير ملتصقة على ركائز صلبة. الخلايا داخل الأنسجة ، ولكن عادة ما تكون مغطاة داخل كتلة الأنسجة معبأة بشكل وثيق في الخلايا التي تنشئ صلات حميمة مع الدول المجاورة والقريبة من العديد من المكونات مع المصفوفة خارج الخلية. تبعا لذلك ، وبيئة والكيميائية والفيزيائية التي تعيشها القوات داخل خلايا الأنسجة 3D تختلف اختلافا جوهريا عن تلك التي يعاني منها الخلايا المزروعة في الثقافة أحادي الطبقة. وقد تبين أن تؤثر بشكل ملحوظ هذا التشكل الخلوي والإشارات. وقد وضعت العديد من الطرق لتوليد الخلايا 3D الثقافات بما في ذلك التغليف من الخلايا في المواد الهلامية الكولاجين 1 أو 2 في مادة بيولوجية السقالات. مثل هذه الأساليب ، وإن كان مفيدا ، لا ألخص الحميم المباشر العمارة خلية التصاق خلايا موجودة في الأنسجة الطبيعية. بدلا من ذلك ، كانوا أكثر بشكل وثيق في نظم الثقافة التقريبية التي فرقت فضفاضة داخل الخلايا واحد من المنتجات meshwork 3D ECM. هنا ، نحن تصف طريقة بسيطة في الخلايا التي يتم وضعها في قطرة شنقا الثقافة والمحتضنة في ظل الظروف الفسيولوجية حتى أنها تشكل الأجسام الشبه الكروية 3D الحقيقي في الخلايا التي هي على تماس مباشر مع بعضها البعض ومع مكونات المصفوفة خارج الخلية. الأسلوب لا يتطلب أي معدات متخصصة ويمكن تكييفها لتشمل إضافة أي عامل بيولوجي بكميات صغيرة جدا التي قد تكون ذات فائدة في توضيح الآثار المترتبة على خلية خلية أو تفاعل الخلايا ECM. ويمكن أيضا أن يستخدم الأسلوب إلى الثقافة المشتركة اثنين (أو أكثر) من السكان مختلفة من الخلايا وذلك لإلقاء الضوء على دور التفاعلات خلية خلية أو خلية ECM - في تحديد العلاقات المكانية بين الخلايا. خلية خلية والتلاحم ، والتصاق الخلايا ECM هي حجر الزاوية لدراسات التنمية الجنينية ، والتفاعل خلية الورم الخبيث في غزو انسجة ، التئام الجروح ، والتطبيقات للهندسة الأنسجة. وهذه الطريقة توفر وسيلة بسيطة لتوليد الأنسجة الخلوية مثل الركام لقياس الخصائص أو النشاط الحيوي للتحليل الجزيئية والكيمياء الحيوية في نموذج ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.
Protocol
1. إعداد تعليق خلية واحدة
- يجب أن تنمو الثقافات الخلية تمسكا التقاء 90 ٪ ، يجب شطف monolayers عندها مرتين مع برنامج تلفزيوني. بعد افراغ جيدا ، إضافة 2 ملل (لوحات 100 ملم) من 0.05 ٪ التربسين EDTA - 1 ملم ، واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى فصل الخلايا. وقف trypsinization بإضافة 2 ملل من المتوسط الشامل واستخدامها بلطف ماصة 5 مل لمتمزج الخليط حتى الخلايا في التعليق. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- إضافة 40 ميكرولتر بمخزون الدناز 10 ملغ / مل ، واحتضان لمدة 5 دقائق على RT. دوامة لفترة وجيزة وأجهزة الطرد المركزي في 200 XG لمدة 5 دقائق.
- تجاهل طاف بيليه وتغسل مع 1 مل كامل نسيج ثقافة المتوسط. أكرر ، ثم الخلايا في resuspend 2 ملل من اكتمال النسيج المتوسط الثقافة.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ، أو الآلي لمكافحة الخلية وضبط تركيز الخلايا إلى 2.5 × 10 6 / مل. لهذه التظاهرة تم استخدام خلية مكافحة TC10 BioRad الآلي.
2. تشكيل قطرات الشنق.
- إزالة الغطاء من طبق نسيج الثقافة 60 مم ومكان 5 مليليتر من برنامج تلفزيوني في قاع الطبق. هذا سوف يكون بمثابة غرفة الترطيب.
- عكس غطاء واستخدام pipettor 20 ميكرولتر إيداع 10 قطرات ميكرولتر على الجزء السفلي من الغطاء. تأكد من أن يتم وضع قطرات بعيدا بما فيه الكفاية بحيث لا يمس. فمن الممكن لوضع ما لا يقل عن 20 نقطة في الطبق.
- اقلب الغطاء على PBS غرفة مليئة القاع واحتضان ثاني أكسيد الكربون في 37 ° C / 5 ٪ / 2 الرطوبة 95 ٪ ، ومراقبة قطرات اليومية واحتضان حتى أوراق الخلية أو المجاميع شكلت. ويمكن استخدام مجهر ستيريو تشكيل لتقييم مجموع المباراتين.
- مرة واحدة شكل صفائح ، ويمكن تحويلها إلى شاكر الزجاج جولة القاع القوارير التي تحتوي على 3 ملل المتوسطة كاملة والمحتضنة في حمام مائي تهتز عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 حتى شكل الأجسام الشبه الكروية.
3. تلاحظ
- اعتمادا على حجم الخلية ، قد تحتاج إلى تركيز حتى يتم تعديل أو إلى أسفل.
- يمكن أن تكون ملطخة غشاء الخلايا مع الإقحام الأصباغ الفلورية قبل تشكيل قطرة شنقا.
- يمكن أن يكون اثنان أنواع مختلفة من الخلايا الملون تفاضلي والمختلط في نسبة (أو غيرها) 01:01 قبل تشكيل قطرات شنقا. يمكن أن تكون هذه الخلايا السرطانية واللحمية والأنسجة الجنينية ، أو الخلايا المعدلة وراثيا لجعل التواقيع لاصقة معينة.
- يمكن فصل الخلايا من الأطباق باستخدام زراعة الأنسجة التربسين 0.05 ٪ / 2 ملي الكالسيوم للحفاظ على وظيفة كادهيرين.
- اعتمادا على التجربة ، يمكن إما أن يكون ورقة قياس الأحجام ، أو يمكن استخدامها لاختبار الركام أو ميكانيكية أو البيوكيميائية للتحليل الجزيئي.
4. ممثل النتائج :
ورقة أو تشكيل كروي يحدث عادة في غضون 24 ساعة ، ولكن قد يستغرق وقتا أطول اعتمادا على نوع من الخلايا. الشكل 1 يمثل الصور الملتقطة بعد 18 ساعة من الحضانة من دون علاج خلايا سرطان البروستاتا (MLL) MAT - LyLu شنقا في ثقافة الإفلات (الشكل 1A) أو الخلايا المعالجة مع 25 ميكرومتر المانع PD98059 مجاهدي خلق. علما بأن نتائج العلاج مكي في الضغط واضح في ورقة الخلية. ويمكن قياس الضغط عن طريق قياس حجم 10-20 (أو أكثر) شنقا قطرات ومقارنة بين متوسط حجم مجموعات العلاج. عادة ما نقوم بتحليل الصور باستخدام البرمجيات التي ImageJ thresholding كل صورة ثم تحويل الصور إلى الوضع الثنائي ، وعندها نطبق تحليل للكشف عن الجسيمات صورة المنطقة في إجمالي بكسل. ويمكن بعد هذا يمكن تحويلها بسهولة إلى ميكرون مربع. يمثل الشكل 2 مقارنة لحجم الخلايا غير المعالجة وMLL مكي المعاملة. كما لوحظ ، مكي العلاج يقلل بشكل ملحوظ مقارنة حجم ورقة من خلال اختبار - T الطالب (ف <0.0001). لإجراء هذه المقارنة ، تم قياس 10 المجاميع لكل من الخلايا غير المعالجة والمعالجة. الشكل 3 يمثل كروي الفرخ الكبد الجنينية التي تشكلت بعد 24 ساعة معلقة في ثقافة الإفلات و 2 يوما في حمام شاكر.
يمكن أيضا فحص قطرة شنقا يمكن تعديلها لتشمل اكثر من نوع من الخلايا للكشف عن المواقع المكانية المعتمدة. على سبيل المثال ، يمكن عزل الخلايا الجنينية الفرخ الكبد ، ملطخة صبغة الأغشية الفلورية الإقحام وخلطها مع خلايا القلب الجنينية الفرخ التي تم ملطخة علامة الفلورسنت مختلفة. ويبين الشكل 4A أنه بدلا من المتبقية مختلطة ، والكبد والقلب والخلايا تميل إلى "خارج الفرز" من جهة اخرى واحدة واعتماد المجال داخل واحد في مجال التكوين في خلايا القلب والتي يلفها من قبل خلايا الكبد. ويمكن تفسير هذا الاختلاف في التكوين عن طريق الالتصاق بين الخلايا بين خلايا الكبد والقلب. وتقنن هذا المفهوم في الالتصاق التفاضلية الفرضية التي تم استخدامها لتفسير سلوك الخلية الفرز بين الأنسجة الجنينية الجرثومية للطبقة البرمائيات 3 و 4 أجنة مكتملة العظام ، لتنظيم خلايا البنكرياس جزيرة لخلية (5) والفرز بين سكان الخلية متطابقتين طن كل احترام الآخرين من التعبير عن مستويات من نفس النوع من كادهيرين (6 و الشكل 4B). هذه النتيجة مهمة خاصة لإظهار كيف فرقا هندسية بسيطة في الالتصاق بين السكان الخلية قد ينتج جيل من هيكل الجهاز ، على سبيل المثال ، جزيرة البنكرياس 5.
الشكل 1. صور من الخلايا المحتضنة في شنقا ثقافة الإفلات لمدة 18 ساعة اما في غياب (A) أو وجود (ب) من 25 ميكرون من مثبط PD98059 مجاهدي خلق. والتقاط الصور باستخدام الكسوف نيكون TE 300 epifluorescence المجهر والكاميرا الرقمية CoolSnap Photometrics ES.
الشكل 2. الكمي لمكي بفعل الضغط من الفئران خلايا البروستات MLL السرطان. وحضنت الثقافات قطرة شنقا من الخلايا غير المعالجة وMLL مكي المعاملة لمدة 18 ساعة عندها تم تحديد الحجم الإجمالي كما هو موضح أعلاه. وكان التحليل الإحصائي للحجم الكلي من قبل الطالب اختبار t. النجمة تمثل فروق ذات دلالة إحصائية في الحجم الكلي (P <0.0001) بين الخلايا غير المعالجة والمعالجة مكي وتشير إلى أن النتائج مكي المعاملة في مجاميع أصغر بكثير وأكثر إحكاما.
الشكل 3 ألف كروي شكلتها احتضان خلايا الكبد الجنينية في الفرخ شنقا ثقافة الإفلات لمدة 18 ساعة ثم في حاضنة / هز الحمام لمدة 48 ساعة. تم القبض على هذه الصورة باستخدام المجهر نيكون SMZ800 ستيريو وكاميرا سوني اتفاقية مكافحة التصحر الأسود.
الشكل 4. الشنق ثقافة الإفلات يكشف الفرز التدريجي السلوك بين أنواع مختلفة من الخلايا. في لوحة ألف ، تم صبغ الخلايا الجنينية الفرخ الكبد مع صبغة الإقحام PKH - 2 الغشاء ومختلطة في نسب متساوية مع PKH - 26 الخلايا الجنينية الفرخ القلب الملون. B في الفريق ، وكانت ملطخة أيضا اثنين من خلية L - N - كادهيرين transfected استنساخ (LN4 وLN2a) ، معربا عن N - نذل على سطوحها في نسبة 2.4:1 ، مع غشاء الأصباغ الفلورية الإقحام PKH - 2 و 26 PKH (سيغما الدريخ) ، مختلطة بنسب متساوية والمثقف كما شنقا قطرات 7. بعد 18 ساعة في الثقافة ، تم نقل صفائح الخلايا لقوارير تهتز والمحتضنة لمدة 48 ساعة. كانت ثابتة في المجاميع بارافورمالدهيد 2 ٪ في الفوسفات مخزنة المالحة وشوهدت مع BioRad MRC600 نظام ليزر متحد البؤر المسح المجهر المرفقة المجهر Optiphot - 2 نيكون. وقد تم جمع المقاطع البصرية على حد سواء من قنوات خضراء وحمراء وGraphix سيليكون محطة VGX قرمز مجهزة صور الحيوية استخدمت برامج التصوير فوكسل مشاهدة الترا لتعيين لون كاذبة لكلا القنوات ودمج الصور ، وكشف عن التكوينات التشريحية ولدت (A) القسم مبائر البصرية من خلال التظاهر التغليف الكلي لخلايا القلب (هنا في اللون الأصفر الزائفة) بواسطة خلايا الكبد في الزرقاء pseudocolor (من 8). (ب) القسم متحد البؤر البصرية من خلال التظاهر التغليف الكلي لخلايا N - كادهيرين عالية معربا عن (الأخضر) من قبل الذين يعبرون عن مستويات أقل من N - كادهيرين (أحمر) (من 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أظهرت الدراسات أن خلايا زراعة في سياق ثلاثي الأبعاد (3D) تنتج التشكل الخلوية متميزة ويشير عند مقارنة جامدة ثنائي الأبعاد نظام الثقافة (2D) 9. على سبيل المثال ، والهلام الكولاجين الليفية المأهولة تثبت أن الخلايا الليفية في التشكل 3D يختلف تماما عن تلك التي لوحظت في 2D 10،11. وبالمثل ، يمكن أن تحفز الأنسجة 3D ثقافة محددة تمايز الخلايا الظهارية الثديية. وقد استخدمت أنظمة 3D ثقافة للتمييز بين الخلايا الطبيعية والخبيثة ، ولقد تبين لدعم الارتداد من الخلايا تحولت إلى النمط الظاهري العادي ، بالنظر إلى الحوافز المناسبة 12،13 جنيه ، كما تم تصحيح هندسة الأنسجة أظهرت أن تكون حيوية بالنسبة المدى الطويل التوازن ، وقمع موت الخلايا المبرمج ، والحفاظ على النمط الظاهري متباينة من الخلايا الظهارية CID - 9 الثديية 14. متعددة الخلايا المقاومة للأدوية في الماوس EMT - 6 كما تم خلايا سرطان الثدي أظهرت أن تتجلى في المختبر فقط إذا ما نمت الخلايا في تكوينات 3 - D وليس في الثقافات التقليدية أحادي الطبقة 15. وقد أدت هذه وغيرها من البيانات إلى اقتراح أن "وحدة من وظيفة أعلى في الكائنات ليست الجينوم ولا الخلية وحدها ، ولكن النسيج نفسه" (16). طرق عديدة أخرى لتوليد الأجسام الشبه الكروية 3D الوجود ، بما في ذلك استخدام حاضنات محاكاة الجاذبية الصغرى 17 ، والدقيقة مصبوب غير لاصقة الهلاميات المائية 18،19. خلافا لهذه الأساليب إلا أن الأسلوب هو موضح هنا لا يتطلب أي معدات متخصصة أو الكاشفة ، وبالتالي عالية المردود. بساطة الأسلوب يقلل من المخاطر المحتملة. وبالتالي فإن منحنى التعلم ضحلة نسبيا ويمكن بسهولة يتقن الأسلوب في غضون فترة قصيرة نسبيا من الزمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويود الكاتب أن أشكر الدكتور Dongxuan جيا للمساعدة التقنية. وكانت بعض الصور التي تظهر في هذه المقالة بالتعاون مع الدكتور س. شتاينبرغ مالكولم ، قسم علم الأحياء الجزيئي في جامعة برينستون. فإن المؤلف أود أيضا أن أشكر وزارة الدفاع لسرطان البروستاتا برنامج بحوث (منح PC - 030482 - 991552 والكمبيوتر) ولجنة التحقيق الوطنية / المعاهد الوطنية للصحة (منحة R01CA118755) على دعمهم السخي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic cell counter | Bio-Rad | TC10 | |
| shaking water bath with CO2 gable cover | Labline Instruments | 3540 |
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).
- Davis, G. S., Phillips, H. M., Steinberg, M. S. Germ-layer surface tensions and "tissue affinities" in Rana pipiens gastrulae: quantitative measurements. Dev Biol. 192, 630-644 (1997).
- Schotz, E. M. Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning. HFSP J. 2, 42-56 (2008).
- Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Dev Biol. 278, 255-263 (2005).
- Li, D. Expression of the casein kinase 2 subunits in Chinese hamster ovary and 3T3 L1 cells provides information on the role of the enzyme in cell proliferation and the cell cycle. J Biol Chem. 274, 32988-32996 (1999).
- Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122, 1611-1620 (1996).
- Wendt, D., Riboldi, S. A., Cioffi, M., Martin, I. Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing. Adv Mater. 21, 3352-3367 (2009).
- Berry, D. P., Harding, K. G., Stanton, M. R., Jasani, B., Ehrlich, H. P. Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts. Plast Reconstr Surg. 102, 124-131 (1998).
- Grinnell, F. Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices. Trends Cell Biol. 13, 264-269 (2003).
- Wang, F. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14821-14826 (1998).
- Weaver, V. M. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Boudreau, N., Werb, Z., Bissell, M. J. Suppression of apoptosis by basement membrane requires three- dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 3509-3513 (1996).
- Croix, B., Rak, J. W., Kapitain, S., Sheehan, C., Graham, C. H., Kerbel, R. S. Reversal by hyaluronidase of adhesion-dependent multicellular drug resistance in mammary carcinoma cells. J. Nat. Cancer Inst. 88, 1285-1296 (1996).
- Bissell, M. J. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).
- Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 523-534 (2009).
- Napolitano, A. P. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43, 494-496 (2007).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).
