Summary
Biz 3D doku parçacıklarının ve potansiyel uygulama üreten hücre-hücre etkileşimleri farklılıkları ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Katı yüzeye yapışık tek tabaka kültürler, hücre-hücre uyum ve hücre alt tabaka yapışma çalışmalar tarihsel yapılmamıştır. Ancak, Hücreler, doku içinde hücrelerin çok yakın komşuları ile ve ekstrasellüler matriks bileşenleri ile yakın bağlantıları kurmak yakından paketlenmiş bir doku kitlesi içinde genellikle kaplı bulunmaktadır. Buna göre, kimyasal ortam ve 3D doku hücreleri içinde yaşadığı fiziksel kuvvetlerin tek tabaka kültüründe yetişen hücreleri tarafından deneyimli dışında temelde farklı. Bu hücresel morfoloji ve sinyalizasyon belirgin etkisi gösterilmiştir. Kollajen jeller 1 veya biyomalzeme iskelelerde 2 hücre de dahil olmak üzere kapsülleme 3D hücre kültürleri oluşturmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu tür yöntemler, yararlı olmakla beraber, normal dokularda bulunan samimi doğrudan hücre-hücre adezyon mimarisi özetlemek değil. Aksine, onlar daha yakından yaklaşık kültür sistemleri tek hücre, gevşek bir 3D ECM ürünleri ağ örgüsü içinde dağılmış bulunmaktadır. Burada, basit bir yöntem hücreleri açılan kültür asılı olarak yerleştirilir ve hücrelerin birbirleri ile ve ekstrasellüler matriks bileşenleri ile doğrudan temas halinde olan gerçek 3D parçacıklarının oluşana kadar fizyolojik şartlar altında inkübe olduğu açıklanmaktadır. Bu yöntem hiçbir özel ekipman gerektirir ve hücre-hücre veya hücre-ECM etkileşimi üzerindeki etkileri nedenlerine açıklık ilgi olabilir çok küçük miktarlarda herhangi bir biyolojik ajan eklenmesi için adapte edilebilir. Yöntemi de ko-kültür iki (veya daha fazla) farklı hücre popülasyonlarının hücreleri arasındaki mekansal ilişkileri belirterek, hücre-hücre veya hücre-ECM etkileşimleri rolünü aydınlatmak için kullanılabilir. , Hücre-hücre uyum ve hücre-ECM yapışma malign invazyon, yara iyileşmesi, doku mühendisliği uygulamaları için embriyonik gelişim, stromal tümör hücre etkileşimi çalışmaları temel taşlarından. Bu basit bir yöntem gibi doku biyomekanik özellikleri ölçümü veya hücresel, fizyolojik ilgili bir model moleküler ve biyokimyasal analiz için agrega üreten bir araç sağlayacaktır.
Protocol
1. Tek Bir Hücre Süspansiyon hazırlanması
- Bunun üzerine mono tabakaları yapışmış hücre kültürleri,% 90 izdiham büyüdü olmalıdır PBS ile iki kez durulanır olmalıdır. De boşalttıktan sonra, 2 ml% 0.05 tripsin-1 mM EDTA (100 mm plaka için) ekleyin ve 37 inkübe ° C hücreleri ayırmak kadar. 2 ml tam orta ekleme ve hücreleri süspansiyon kadar karışımı hafifçe çiğnemek için 5 ml pipet kullanın trypsinization Dur. 15 ml konik tüp hücreleri aktarın.
- RT az 5 dakika için 10 mg / ml DNAz stok ve inkübe 40 ul ekleyin. 5 dakika boyunca 200 XG Vortex kısa ve santrifüj.
- Süpernatant atın ve 1 ml tam doku kültür ortamı ile yıkayın pelet. Tekrarlama, daha sonra tekrar süspansiyon hücrelerin doku kültürü orta 2 ml.
- Hemasitometre, ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak hücre sayımı ve 2.5 x 10 6 hücre / ml konsantrasyon ayarlayabilirsiniz. Bu gösteri için bir BioRad TC10 otomatik hücre sayıcı kullanılmıştır.
2. Asma Damlalar oluşumu.
- 60 mm doku kültürü çanak ve çanak alt PBS 5 ml kapağını kaldırın. Bu hidrasyon odası olarak hareket edecektir.
- Kapağını ters çevirin ve alt kapağın üzerine 10 ul damla yatırmak için 20 ul pipet kullanın. Dokunmatik olarak damla yeteri kadar ayrı yerleştirildiğinde olduğunu emin olun. Bulaşık başına en az 20 damla yerleştirmek mümkündür.
- 37 ° PBS-dolu alt odası ve inkübe ° C /% 5 CO 2 /% 95 nem üzerine kapağı, invert günlük damla izlemek ve hücre yaprak veya agrega ya oluşturmuşlardır kadar inkübe. Stereo mikroskop toplam oluşumu değerlendirmek için kullanılabilir.
- Yaprak formunda yuvarlak alt cam çalkalayıcı transfer olabilir tam orta 3 ml içeren ve 37 sallayarak bir su banyosunda inkübe şişeler ° C ve% 5 CO 2 parçacıklarının formu kadar.
3. Notlar
- Hücre boyutu bağlı olarak, konsantrasyon yukarı veya aşağı ayarlanması gerekebilir.
- Hücreler, membran asılı damla oluşumu önce floresan boyalar intercalating ile boyanmış olabilir.
- İki farklı hücre tipleri farklı asılı damla oluşumu öncesinde bir 1:1 (veya diğer) oranı boyanmış ve karışık olabilir. Bu kanser ve stromal hücreler, embriyonik dokuların veya hücrelerin genetik özel yapıştırıcı imzaları için tasarlanmış olabilir.
- Hücreler, doku kültürü yemekleri kaderin fonksiyonunu korumak için% 0.05 tripsin / 2 mM kalsiyum kullanarak ayrılabilir.
- Deney bağlı olarak, levha boyutları da ölçülen olabilir, ya da büyüklükler mekanik test veya biyokimyasal veya moleküler analiz için kullanılabilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Yaprak veya sfero oluşumu genellikle 24 saat içinde ortaya çıkar, ancak hücre tipine bağlı olarak uzun sürebilir. Şekil 1, tedavi edilmemiş prostat kanserinin MAT-LyLu (MLL) açılan kültür asılı hücreleri (Şekil 1A) ya da 25 mikron MEK inhibitörü PD98059 ile tedavi edilen hücreler inkübasyon 18 saat sonra çekilen görüntülerin temsil eder. Not hücre sac belirgin bir sıkışma olduğunu MEKi tedavi sonuçları. Sıkıştırma 10-20 boyutunu (veya daha fazla) damla asılı ve tedavi grupları arasında ortalama büyüklüğü karşılaştırılarak ölçerek belirlenebilir. Toplam piksel görüntü alanını ortaya çıkarmak için parçacık analizi uyguladıktan bunun üzerine Biz genellikle, İkili Mod görüntüleri daha sonra her bir görüntü eşikleme dönüştürme ImageJ yazılımı kullanarak görüntüleri analiz. Bu kare mikron sonra kolayca dönüştürülebilir. Şekil 2, tedavi edilmeyen ve tedavi edilen MEKi MLL hücreler için bir boyut karşılaştırma temsil eder. Student t-testi (p <0.0001) ile karşılaştırıldı olarak belirtildiği gibi, MEKi tedavi, yaprak boyutu önemli ölçüde azaltır. Bu karşılaştırma için, tedavi edilmeyen ve tedavi edilen hücrelerde her biri için 10 agrega ölçüldü. Şekil 3, 24 saat ve 2 gün çalkalayÛcÛ banyosu sonra açılan kültür asılı oluşan bir civciv embriyonik karaciğer sfero temsil eder.
Asılı damla tahlil de mekansal konumlandırma benimsedi ortaya çıkarmak için birden fazla hücre tipi içerecek şekilde modifiye edilebilir. Örneğin, bir membran intercalating floresan boya ile boyanmış ve farklı bir floresan işaretleyici ile boyandı civciv embriyonik kalp hücreleri ile karışık civciv embriyonik karaciğer hücreleri izole edilebilir. Yerine kalan daha karışmış Şekil 4A gösterir, karaciğer ve kalp hücrelerinin biri diğerine "sort-out" eğilimi ve benimseyen bir küre içinde bir küre kalp hücreleri, karaciğer hücreleri tarafından zarflı olduğu yapılandırma. Bu yapılandırma, karaciğer ve kalp hücreleri arasındaki interselüler adezyon farklılıklarla açıklanabilir. Bu kavram, pankreas adacık hücre organizasyonu 5 ve hücre aynı iki hücre popülasyonları arasındaki sıralama için, amfibi 3 ve teleost 4 embriyolar için embriyonik germ tabakası doku arasındaki davranış sıralama hücre açıklamak için kullanılır olmuştur Diferansiyel Yapışma Hipotez kodlanmış .n kaderin aynı tip (6 ve Şekil 4B) ekspresyon düzeyleri dışında her açıdan. Bu sonuç, yapışma, hücre popülasyonlarının arasında basit bir fark mühendislik nasıl göstermek için özellikle önemlidir, örneğin, organ yapısı nesil neden olabilir, pankreas adacık 5.
Şekil 1 damla kültür, ya da (A) yokluğu ya da varlığı 18 saat asılı inkübe hücreler Görüntüler (B) MEK inhibitörü PD98059 25 mikron . Görüntüler Nikon Eclipse TE 300 Epifloresans mikroskop ve bir Photometrics CoolSnap ES dijital fotoğraf makinesi ele geçirildi.
Şekil 2 MEKi indüklenen sıçan prostat kanseri MLL hücreleri sıkıştırma Niceleme. Tedavi edilmemiş ve tedavi edilen MEKi MLL hücrelerinin asılı damla kültürleri yukarıda açıklandığı gibi toplam büyüklüğü tespit edildi bunun üzerine 18 saat süreyle inkübe edildi. Toplam büyüklüğü istatistiksel analizi Student t-testi ile oldu. Yıldız işareti, önemli ölçüde daha küçük ve daha kompakt agrega toplam boyutu tedavi edilmeyen ve tedavi edilen MEKi hücreleri ve önerir MEKi tedavi sonuçları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark (p <0.0001) temsil eder.
Şekil 3, 18 saat sonra bir kuluçka bırak kültür asılı / 48 saat boyunca banyo sallayarak civciv embriyonik karaciğer hücreleri kuluçka oluşan sfero . Bu görüntü Nikon SMZ800 stereo mikroskop ve bir Sony Siyah CCD kamera kullanılarak yakalandı.
Şekil 4 damla kültürü farklı hücre türleri arasındaki davranış Hanging sıralama ortaya koyuyor. Panelinde, civciv embriyonik karaciğer hücreleri PKH-2 membran intercalating boya ile boyandı ve PKH-26 lekeli civciv embriyonik kalp hücrelerinin eşit oranda karıştırılır. Panel B, 2.4:1 oranı yüzeyler N-cad ifade iki N-kaderin-transfekte L hücre klonlarının (LN4 ve LN2a), floresan membran intercalating boyalar PKH-2 ve PKH-26 ile boyandı (Sigma-Aldrich) eşit oranda karıştırılır ve damla 7 asılı olarak kültür. 18 saat sonra kültür, hücre sayfaları sallayarak şişeler transfer edildi ve 48 saat inkübe edilebilir. Büyüklüklerdeki% 2 paraformaldehid sabit tuzlu fosfat tamponlu ve Nikon Optiphot-2 mikroskop bağlı bir BioRad MRC600 lazer tarama konfokal mikroskop sistemi ile görüntülenebilir. (A) yeşil ve kırmızı her iki kanal Optik bölümleri toplanmış ve Vital Resimler ile donatılmış bir Silikon Graphix Crimson VGX iş istasyonu Voksel Ultra görüntüleme yazılımı anatomik yapılandırmaları ifşa sahte renk, her iki kanal atamak ve görüntüleri birleştirmek için kullanılmıştır. Pseudocolor mavi karaciğer hücreleri (8), kalp hücrelerinin bir toplamı gösteren zarflama yoluyla Konfokal optik bölümü (burada sözde-renk sarı) . (B) N-kaderin (kırmızı) (6) düşük seviyelerde ifade ile yüksek N-kaderin ifade hücreleri (yeşil) bir toplamı gösteren zarflama ile Konfokal optik bölümü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çalışmalar, üç boyutlu bir bağlamda (3D) hücreleri kültür farklı hücresel morfoloji ve katı bir iki boyutlu (2D) kültür sistemi, 9 kıyasla sinyalizasyon ürettiğini göstermiştir . Örneğin, fibroblast nüfuslu kollajen jeller 3D fibroblast morfolojisi 2D 10,11 gözlenen oldukça farklı olduğunu göstermektedir. Benzer şekilde, 3D kültürü meme epitel hücrelerinin doku-spesifik farklılaşma neden olabilir. 3D kültür sistemleri, normal ve malign hücrelerin ayırt etmek için kullanılan ve normal bir fenotip dönüştürülmüştür hücrelerinin reversion desteklemek için gösterilmiştir uygun uyaran 12,13 verilen Doğru mimari dokusu da uzun menzilli için hayati olduğu gösterilmiştir homeostazı, apoptozis baskılanması ve CID-9 meme epitel hücreleri 14 farklılaştırılmış fenotip bakım. Hücreleri, geleneksel tek tabaka kültürler 15 3-D yapılandırmaları ve yetiştiği yalnızca fare hücreli ilaç direnci EMT-6 meme kanseri hücreleri in vitro tecelli gösterildiği olmuştur . Bu ve diğer verileri 16 "yüksek organizmalarda fonksiyon ünitesi, ne de tek başına hücre genomu, ancak doku kendisinin ne olduğu" önerisini getirdi . Simüle mikrogravite inkübatörler 17, ve mikro-kalıplı yapışkan olmayan hidrojeller 18,19 kullanımı da dahil olmak üzere, 3D parçacıklarının üreten diğer birçok yöntemler vardır. Ancak bu yöntemlerin aksine, burada anlatılan yöntem, hiçbir özel ekipman veya reaktiflerin gerektirir ve bu nedenle son derece düşük maliyetli. Yöntemin basitliği potansiyel tuzaklar en aza indirir. Sonuç olarak, öğrenme eğrisi nispeten sığ ve yöntem zaman görece kısa bir süre içinde kolayca üstesinden gelinebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazar Dr. Dongxuan Jia teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu makalede ortaya çıkan görüntülerin bazıları Dr Malcolm S. Steinberg, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı, Princeton Üniversitesi ile işbirliği içinde. Yazar ayrıca, Savunma Prostat Kanseri Araştırma Programı (hibe 030.482 PC ve PC-991.552) Bakanlığı ve NCI / NIH (hibe R01CA118755) cömert desteği için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic cell counter | Bio-Rad | TC10 | |
| shaking water bath with CO2 gable cover | Labline Instruments | 3540 |
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).
- Davis, G. S., Phillips, H. M., Steinberg, M. S. Germ-layer surface tensions and "tissue affinities" in Rana pipiens gastrulae: quantitative measurements. Dev Biol. 192, 630-644 (1997).
- Schotz, E. M. Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning. HFSP J. 2, 42-56 (2008).
- Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Dev Biol. 278, 255-263 (2005).
- Li, D. Expression of the casein kinase 2 subunits in Chinese hamster ovary and 3T3 L1 cells provides information on the role of the enzyme in cell proliferation and the cell cycle. J Biol Chem. 274, 32988-32996 (1999).
- Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122, 1611-1620 (1996).
- Wendt, D., Riboldi, S. A., Cioffi, M., Martin, I. Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing. Adv Mater. 21, 3352-3367 (2009).
- Berry, D. P., Harding, K. G., Stanton, M. R., Jasani, B., Ehrlich, H. P. Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts. Plast Reconstr Surg. 102, 124-131 (1998).
- Grinnell, F. Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices. Trends Cell Biol. 13, 264-269 (2003).
- Wang, F. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14821-14826 (1998).
- Weaver, V. M. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Boudreau, N., Werb, Z., Bissell, M. J. Suppression of apoptosis by basement membrane requires three- dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 3509-3513 (1996).
- Croix, B., Rak, J. W., Kapitain, S., Sheehan, C., Graham, C. H., Kerbel, R. S. Reversal by hyaluronidase of adhesion-dependent multicellular drug resistance in mammary carcinoma cells. J. Nat. Cancer Inst. 88, 1285-1296 (1996).
- Bissell, M. J. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).
- Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 523-534 (2009).
- Napolitano, A. P. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43, 494-496 (2007).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).
