Dominio transmembrana Oligomerización propensión determinada por el ensayo toxR

Resumen

Un procedimiento eficaz para evaluar la propensión de oligomerización dominios transmembrana de un solo paso (TTM) se describe. Proteínas quiméricas que consiste en la DTM fundido a toxR se expresan en una cepa de E. coli reportero. TMD inducida por oligomerización causas dimerización de toxR, activación de la transcripción y la producción de la proteína reportera,-galactosidasa.

Resumen

El punto de vista simplista de los dominios transmembrana de la proteína como un mero anclas en bicapas de fosfolípidos desde hace mucho tiempo que ya fueron desbancados. En muchos casos, que atraviesa la membrana las proteínas han desarrollado mecanismos muy sofisticados de acción. ^3.1 Una forma en que las proteínas de membrana son capaces de modular sus estructuras y funciones es por contacto directo y específico de las hélices hidrofóbicas, formando oligómeros estructura transmembrana. ^4,5 Mucho recientes el trabajo se ha centrado en la distribución de los aminoácidos preferentemente en el medio ambiente de la membrana en comparación con una solución acuosa y las fuerzas intermoleculares diferentes que la asociación de proteínas en coche. ^6,7 Sin embargo, los estudios de reconocimiento molecular en el dominio transmembrana de las proteínas aún por detrás de los de soluble en agua las regiones. El principal obstáculo sigue siendo: a pesar de la especificidad y afinidad notable que oligomerización transmembrana puede lograr, ⁸ medición directa de su asociación es un reto. Las metodologías tradicionales aplicadas al estudio de la función integral de proteína de la membrana puede ser obstaculizada por la insolubilidad inherente de las secuencias en estudio. Puntos de vista biofísico adquiridos al estudiar péptidos sintéticos que representan los dominios transmembrana puede proporcionar una visión estructural de utilidad. Sin embargo, la importancia biológica de las micelas de detergente o de los sistemas de liposomas utilizados en estos estudios para imitar las membranas celulares con frecuencia se cuestiona, no adoptar una estructura de péptidos nativos-como en estas condiciones y que su comportamiento funcional, reflejen verdaderamente el modo de acción dentro de una membrana nativa ? Con el fin de estudiar las interacciones de las secuencias transmembrana en bicapas de fosfolípidos naturales, el laboratorio Langosch desarrollado ensayos toxR transcripcional reportero. ⁹ El dominio transmembrana de interés se expresa como una proteína quimérica con la proteína de unión a maltosa para la ubicación de la periplasma y toxR que presente un informe del nivel de oligomerización (Figura 1).

En la última década, varios otros grupos (por ejemplo, Engelman, DeGrado, Shai) optimizado y aplicado este reportero de ensayo toxR. ^10-13 Los ensayos toxR varios se han convertido en un estándar de oro para probar interacciones proteína-proteína en las membranas celulares. Nosotros en este documento demuestran una operación típica experimental llevado a cabo en nuestro laboratorio que todo sigue los protocolos desarrollados por Langosch. Este método de aplicación general es útil para el análisis de dominio de transmembrana la libre asociación de E. coli, donde se utiliza β-galactosidasa de producción para evaluar la propensión oligomerización TMD. Al TMD inducida por dimerización, toxR se une al promotor ctx causando la regulación del gen lacZ de β-galactosidasa. Una lectura colorimétrica se obtiene mediante la adición de ONPG a las células lisadas. Escisión hidrolítica de ONPG por los resultados de β-galactosidasa en la producción de la especie que absorbe la luz o-nitrofenolato (ONP) (Figura 2).

Protocolo

1. Consideraciones sobre la clonación

1. Oligonucleótidos preparados comercialmente, en representación de la TMD de interés flanqueado por NheI y sitios de restricción BamHI y 5 'fosforilados se pueden ligar en pTox7 (modificado en nuestro laboratorio mediante la inserción de un par de bases directamente después de que el sitio de restricción BamHI ¹⁴⁾ (Figura 3) digerido secuencialmente con BamHI y NheI. Un oligonucleótido ejemplo se muestra a continuación:
   5'ctagcTMDSEQUENCEg3 '
   3 'gTMDSEQUENCEcctag5'

La secuencia de TMD debe ser 12-24 residuos (las secuencias más cortas, presumiblemente, se prolongará....

Discusión

El ensayo toxR reportero de la transcripción es una forma fácil para identificar las secuencias transmembrana con el potencial de oligomerize. Dado que las interacciones se producen dentro de la membrana interna bacteriana, este ensayo se eludan las cuestiones relacionadas con la validez de los sistemas que estudian en la membrana mimética-ambientes. Teniendo en cuenta que la clonación de TTM múltiples en un solo plásmido fácilmente se puede hacer en paralelo y el ensayo completo se puede realizar en formato de 96 pocil.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Enzima de restricción BamHI	Invitrogen	15201023	Invitrogen enzimas resultaron ser más eficientes que los proveedores alternativos
NheI enzima de restricción	Invitrogen	15444011	Invitrogen enzimas resultaron ser más eficientes que los proveedores alternativos
Tubos de 15 ml de cultivo	Fisher Scientific	14-956-1J
SOC medios de comunicación	Teknova	S0225	Hecho hasta el volumen adecuado y esterilizado en autoclave.
Medio LB	Sigma-Aldrich	L7275	Hecho hasta el volumen adecuado y esterilizado en autoclave.
Cloranfenicol	Sigma-Aldrich	CO 3 78	Solución stock de 30 mg / ml en etanol almacenados en el congelador
Arabinosa	Fluka	10839	Solución madre de 2,5% (w / v) en el agua almacenada en el congelador
Na 2 HPO 4	Sigma-Aldrich	S9390
NaH 2 PO 4	Sigma-Aldrich	S9638
KCl	Mallinckrodt productos químicos	6858-06
MgSO 4 .7 H 2 O	Sigma-Aldrich	63138
Dodecilsulfato sódico (SDS)	Sigma-Aldrich	L6026
2-nitrofenil β-D-galactopiranósido (ONPG)	Sigma-Aldrich	73660
Z-buffer			16,1 g de Na 2 HPO 4 5,5 g de NaH 2 PO 4 0,75 g de KCl 0.246g MgSO4 Completar hasta 1 l, pH 7,0
Z-buffer/chloroform			200 ml de β-mercaptoetanol, 2 ml de cloroformo, que hasta 20 ml con Z-buffer. Vortex durante 1 min, centrifugar durante 1 min a 800 rpm. Hacer de nuevo para cada plato.
Z-buffer/SDS			160 mg SDS disuelto en 10 ml de Z-buffer
Z-buffer/ONPG			40 mg en 10 ml de ONPG Z-buffer. Hacer de nuevo para cada plato
β-mercaptoetanol	Calbiochem	444203
Anti-MBP anticuerpo monoclonal (HRP conjugado)	NEB	E8038S
Los medios de comunicación con un mínimo de maltosa			1 x M9 sales, el 0,4% de maltosa, 1 mg / ml de tiamina, 2 mM MgSO 4
Placa de 96 pocillos de fondo plano	Sarstedt	83.1835.300
Plate-lector	Beckman Coulter	DTX880 Detector multimodo
Baño de agua	VWRI	89032-204
Incubadora de agitación	FormaScientific