Métodos para evaluar la Beta mediada por la muerte celular por linfocitos T citotóxicos

Resumen

Mediadas por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se pueden utilizar para evaluar las respuestas autorreactivas y los mecanismos de estudio de la muerte celular in vitro. Sin embargo, utilizando células vivas, las técnicas de microscopía confocal microscópicos con tintes fluorescentes, el tipo y la cinética de muerte celular, así como las rutas utilizadas se pueden estudiar con mayor detalle.

Resumen

La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad mediada por células T autoinmunes. Durante la patogénesis, los pacientes se vuelven cada vez más insulinopenia como la producción de insulina se pierde, probablemente esto se debe a la destrucción de las células beta del páncreas por las células T. Comprensión de los mecanismos de la muerte de las células beta en el desarrollo de DT1 proporcionará información para generar una cura efectiva para esta enfermedad. Mediada por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se han utilizado históricamente el radionúclido cromo 51 ⁽⁵¹ Cr) para etiquetar las células diana. Estos objetivos se exponen a las células efectoras y la liberación de ⁵¹ Cr de las células diana se lee como una indicación de la muerte celular mediada por linfocitos. Los inhibidores de la consecuencia de muerte celular en menor liberación de ⁵¹ Cr.

Como células efectoras, se utilizó una población activa autorreactivos clonal de las células CD8 ⁺ linfocitos T citotóxicos (CTL) aislado de un ratón transgénico de valores, tanto para las cadenas alfa y beta del receptor de la célula AI4 T (TCR). Activa las células T AI4 fueron co-cultivadas con ⁵¹ Cr células diana marcadas NIT durante 16 horas, la liberación de ⁵¹ Cr se registró para el cálculo de lisis específica

Las mitocondrias participar en importantes eventos fisiológicos, tales como la producción de energía, la regulación de la transducción de señales, y la apoptosis. El estudio de las células beta mitocondrial cambios funcionales durante el desarrollo de DT1 es una nueva área de investigación. Utilizando el potencial de membrana mitocondrial colorante tetrametil rodamina éster metílico (TMRM) y confocal de imágenes microscópicas de células vivas, que supervisó el potencial de membrana mitocondrial en el tiempo en la línea de células beta NIT-1. Para los estudios de imagen, las células T efectoras AI4 fueron marcadas con el colorante fluorescente tinción nuclear Picogreen. NIT-1 en las células y las células T fueron co-cultivadas en cubreobjetos y cámaras montadas en la platina del microscopio equipado con una cámara de células vivas, controlada a 37 ° C, con 5% de CO _2, y húmedo. Durante estos experimentos se tomaron imágenes de cada grupo cada 3 minutos durante 400 minutos.

Más de un curso de 400 minutos, se observó la disipación del potencial de membrana mitocondrial en NIT-1, donde grupos de células AI4 las células T se adjunta. En el experimento de control simultáneo donde NIT-1 células fueron co-cultivadas con MHC mal emparejado las células Jurkat de linfocitos, el potencial de membrana mitocondrial se mantuvo intacta. Esta técnica se puede utilizar para observar en tiempo real los cambios en el potencial de membrana mitocondrial en las células bajo el ataque de los linfocitos citotóxicos, citocinas u otros reactivos citotóxicos.

Protocolo

1. Preparación de las células

1. Objetivo el cultivo de células: la cultura de las líneas celulares de ratón beta, NIT-1 y NIT-4, fue de ^1,2 se ha descrito anteriormente en DMEM suplementado con FBS al 10%, 0,02% de BSA, no de aminoácidos esenciales, 15 mM HEPES, 16,5 mm Glocose y penicilina / estreptomicina. El ⁵¹ Cr etiquetado, las células de las semillas en un fondo plano de 96 pocillos placa de cultivo de 5x10 ⁴ células / pocillo en 200 l medio de cultivo. Para los experimentos de microscopía, las células de las semillas en un 8 y Lab-Tak cubreobjetos II de cámara en cámara de 5x10 ⁴ por 500 en el medio de culti....

Discusión

Células T citotóxicas mediadas por muerte de las células beta es la fisiopatología principal de DT1 ^5. Ensayos de CML con ⁵¹ Cr liberación nos permite estudiar el grado de respuesta del efector objetivo ^6. Sin embargo, el proceso detallado y las vías de las células T mediada por la muerte de las células beta aún no está totalmente entendido. Dado que las mitocondrias son esenciales para la función celular beta y la muerte de ^siete, nos hemos centrado en cambios en las mitocond.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
CR-51	Perkin Elmer	NEZ030500IMC
PBS	Cellgro	21-040-60
Tetrametil rodamina éster metílico (TMRM)	Invitrogen	T668
Picogreen	Invitrogen	P7581
AI4 mimotopo	mimotopes.com	secuencia de aminoácidos: YFIENYLEL
IL-2	I + D	485-MI
DMEM	Invitrogen	11885
FBS	HyClone	SH30071.03
Albúmina de suero bovino	Sigma	A8412
HEPES	Cellgro	25-060-Cl
MEM no aminoácidos esenciales	GIBCO	11140
Penicilina / estreptomicina	Géminis	400-109
Rojo fenol libre de DMEM	Sigma	D5303
Incubadora de CO2	Thermo Fisher	HeraCell 150i	Mantenerse estéril para el cultivo celular
Cabina de seguridad biológica	Thermo Fisher	Forma 1440
Tubos desechables cultura, 6x50 mm de vidrio de cal	Pescador	14 a 958-A
Gamma Contador	Perkin Elmer	Asistente de contador automático de Gamma 1470
Microscopio confocal	Zeiss	LSM 510 Meta Confocal	Con platina motorizada y una cámara de células vivas
Pipeta (1 ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl)	Eppendorf
Tubos (ámbar)	Pescador	50819772
Centrífugo	Sorvall Legend RT +	75004377
Hemocitómetro	Fisher Scientific	267110
Microscopio vertical	Zeiss	Axioskop40
NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ ratones	El Laboratorio Jackson	004347
NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ ratones	El Laboratorio Jackson	004348
NOD-AI4α / ratones F1 β	N / A	N / A	Criados en instalaciones para animales UF