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Artículo de método

Intraluminal la arteria cerebral media de oclusión (MCAO) Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en ratones

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DOI:

10.3791/2879

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8 de mayo de 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El intraluminal de arteria cerebral media oclusión (MCAO) es el modelo más empleado entre los modelos experimentales de ictus isquémico. Aquí vamos a demostrar todo el modelo en detalle con la guía de la flujometría láser Doppler, y sus resultados representativos.

Resumen

El accidente cerebrovascular es la tercera causa de muerte y la principal causa de discapacidad en el mundo, con un costo estimado de cerca de $ 70 mil millones en los Estados Unidos en 2009 1,2. El intraluminal de arteria cerebral media oclusión (MCAO) modelo fue desarrollado por Koizumi 4 en 1986 para simular este impactante patología humana en la rata. Una modificación del método de MCAO fue presentado más tarde por Longa 3. Ambas técnicas han sido ampliamente utilizados para identificar los mecanismos moleculares de las lesiones cerebrales derivadas de accidentes cerebrovasculares isquémicos y posibles modalidades terapéuticas 5. Este método relativamente no invasiva en ratas se ha extendido el uso de ratones para tomar ventaja de transgénicos y knock-out cepas de 6,7. El modelo de isquemia focal cerebral, una sutura intraluminal se avanza a través de la arteria carótida interna para ocluir la base del MCA. Retracción de la sutura después de un período de tiempo especificado imita reperfusión espontánea, pero la sutura también pueden ser retenidos de forma permanente. Este vídeo se demuestra los dos enfoques principales para llevar a cabo el procedimiento intraluminal MCAO en ratones en forma escalonada, además de proporcionar ideas para posibles inconvenientes y dificultades. El tejido cerebral isquémico posteriormente se tiñeron por el cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) para evaluar la extensión del infarto cerebral 8.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Florida y está en conformidad con el "Principio de Cuidado de Animales de Laboratorio" (NIH publicación N º 86-23, revisado en 1985).

1. Materiales

  1. Animales: Los ratones machos C57BL / 6 (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, EE.UU.) con un peso 20 a 26 gramos en el momento de la cirugía.
  2. Anestesia:
    1. Máquina de anestesia: La inhalación VetEquip sistema de anestesia (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, EE.UU.).
    2. Anestésicos por inhalación: El isoflurano (Farmacia Baxter, Deerfield, IL).
  3. Instrumentos quirúrgicos: SuperCut tijeras Iris y recto (Instrumentos de Precisión World, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.); Vannas micro-tijeras y recto (Instrumentos World Precision, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.), Dumont pinzas (de punta fina, 45 ° puntas dobladas, Instrumentos del Mundo de precisión, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.), unidad de coagulación bipolar (Desecador Alta Frecuencia 900, Instrumentos del Mundo de precisión, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.), clip de buques micro (Instrumentos del Mundo de precisión, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.)
  4. Material quirúrgico: puntas estériles de algodón, toallitas húmedas, gasas, suturas (7-0 sutura de seda, Ethicon, Inc., Somerville, NJ, EE.UU.), adhesivo tisular (Vetbond, 3M Company, St. Paul, MN, EE.UU.), lavado quirúrgico : Bethadine, el 70% de etanol, y estéril salina al 0,9%; Ungüento para los ojos (ungüento Puralube Vet, Pharmaderm, Melville, NY, EE.UU.).
  5. La oclusión de sutura preparación para MCAO:
    1. Filamento de MCA oclusión: 7-0 suturas quirúrgicas monofilamento de nylon (Ethicon, Inc., Somerville, NJ, EE.UU.).
    2. Fuente de calor para embotar la punta de sutura (Unidad de cauterio térmico, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL).
    3. De silicona líquida de caucho (silicona RTV adhesivo, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.).
  6. Cirugía / Microscopio de disección (microscopio Leica Stereo MZ6).
    1. Iluminación de fibra óptica (iluminador de fibra óptica FO1-150, TechniQuip Corp., Livermore, CA, EE.UU.).
  7. Flujometría láser Doppler (Periflux System 5000, Perimed, Estocolmo, Suecia).
    1. Flexible micropunta (micropunta MT B500-0 recta, Perimed, Estocolmo, Suecia)
  8. Parámetros de temperatura:
    1. Controlar temperaturas rectales (MTD-12, Instrumentos del Mundo de precisión, Inc., Sarasota, FL).
    2. Manta térmica (T / bomba, TP600, Gaymar, NY, EE.UU.).
  9. Las manchas y la medición cuantitativa de infarto de volumen:
    1. 2% de solución de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC 2%, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, EE.UU.).
    2. Los ratones del cerebro matriz cortadora (Zivic-Miller laboratorio., Inc., Allison Park, PA, EE.UU.).
    3. Cámara digital (V1253, Kodak Co., Rochester, NY, EE.UU.).
    4. Image J software (software ImageJ 1.42q, EE.UU. National Institutes of Health, Bethesda, MA, EE.UU.).

2. Pre-quirúrgico pasos

  1. Antes de la cirugía, los ratones se encuentran en un 12:12 luz / oscuridad ciclo con acceso libre a comida y agua de roedores.
  2. Suturas para MCAO son preparados por embotamiento de 1-2mm de la punta del hilo de sutura con el calor y la capa 3 a 4 mm del eje de la sutura de la punta con caucho de silicona líquido, permitiendo que se seque (7-0; diámetro de la punta, 0.20-0.25 mm, revestimiento de longitud, 3-4mm, longitud de la sutura 11-13mm). La esterilidad se debe preservar en todos los pasos antes mencionados.
  3. Después de sopesar el ratón, la anestesia se induce con un 4% de isoflurano en una cámara de inducción y mantenimiento durante el procedimiento de 1.5-2% de isoflurano en el 30% de O 2 y el 70% de N 2 O mezcla de gas a través de una mascarilla.
  4. El ratón es colocado en una posición en decúbito prono sobre una gasa acostado en una superficie de trabajo con control de temperatura (manta térmica), la piel de la cabeza rapada.
  5. Ungüento oftálmico lubricante se aplica tanto a los ojos y los párpados se cierran los ojos para evitar la desecación durante el proceso quirúrgico.
  6. Una incisión (1 cm) se hace en la piel que recubre la bóveda craneal de la línea nucal superior a la nasion y la piel se estira lateralmente para fijar un micropunta flexible (MT B500-0 micropunta recta, 0,5 mm de diámetro). El micropunta se coloca perpendicular a la superficie del cráneo parietal derecho (1 mm por detrás y 5 mm lateral al bregma) para controlar el flujo de sangre en el territorio de la ACM por flujometría láser-doppler.
  7. Asegúrese de que la micropunta flexible unidos al cráneo con firmeza antes de que el animal se volvió hacia una posición de decúbito supino. El cuello del animal se coloca en una almohadilla suave y su nariz se lleva a cabo en el cono de la nariz del aparato de anestesia. Esto se traducirá en tener suficiente espacio para la micropunta flexible.
  8. Una sonda de temperatura rectal se inserta para mantener una temperatura constante de animales núcleo de 37 ± 0,5 ° C.
  9. Tanto las patas delanteras y las patas traseras se pegan a la superficie de la plataforma de operación, y la cola se pega al tubo rectal.

    10. 3. MCA oclusión cirugía:

    1. Bajo el microscopio quirúrgico, una incisión en línea media del cuello se realiza con unas tijeras entre el manubrio y la mandíbula con cuidado, levantando la piel suelta.
    2. Los pares de glándulas submandibulares subyacentes son francamente dividida, con la glándula izquierda dejados in situ. La glándula submandibular derecha se retrae cranealmente y asegurados junto con el músculo esternocleidomastoideo.
    3. La división expuesta del músculo omohioideo que cubre la vaina carotídea es cuidadosamente dividida con pastillas.
    4. La arteria carótida común derecha (CCA) ha sido cuidadosamente separados y aislados del nervio vago y su vaina (que se encuentra lateral al CCA).
    5. En adelante, los 2 métodos quirúrgicos que se han utilizado con frecuencia para llevar a cabo MCA oclusión divergen:

    4 de Koizumi método

    1. Tres puntos de sutura collar suelto (7-0 de seda) se preparan todo el derecho de CCA.
    2. La arteria carótida externa (ACE) es identificado, aislado y cauterizar (2-3mm distal a la bifurcación). Posteriormente, se pueden dividir con micro-tijeras. Para evitar daños involuntarios periférica en el sitio de cauterización, la potencia debe fijarse en 1 usando el mando de potencia. Esto es consistente para todas las cauterizaciones.
    3. Suficiente tensión se aplica a la sutura de cuello más proximal de la CCA para ocluir el flujo sanguíneo (ligadura permanente). La oclusión del flujo se verifica una caída de aproximadamente 50% de los valores de perfusión cortical.
    4. A continuación, un clip de recipiente se coloca justo antes de la bifurcación de la CCA para evitar el flujo retrógrado en el momento de la arteriotomía.
    5. Una arteriotomía se realiza entre la sutura proximal liga y el clip de buque en la CCA, con micro-tijeras (el más cercano a la ligadura).
    6. El calor embotado de silicona recubierto de sutura de nylon 7-0 se introduce a través de la arteriotomía y se avanzó hasta que llega el clip de buque. Los dos restantes suturas manuales sueltos apretar ligeramente alrededor de la CCA entre la arteriotomía y el clip de buques para evitar la posterior fuga de flujo a través de la CCA, con cuidado de no traumatizar la pared arterial, y luego el clip de embarcación es retirada.

    3 Longa el método

    1. La ECA ha sido identificado, diseccionado tanto como sea posible (cerca de su bifurcación en las arterias lingual y maxilar), cauterización (con el poder establecido en 1), y se divide en micro-tijeras.
    2. Dos puntos de sutura collar suelto (7-0 de seda) se preparan en todo el proximal ICA justo por encima de la bifurcación de la CCA.
    3. La CCA se encuentra temporalmente cerrado con un clip de buque. La oclusión del flujo se verifica una caída de aproximadamente 50% de los valores de perfusión cortical.
    4. Luego, el ICA se encuentra temporalmente cerrado con un clip de buque por encima de las dos suturas collar suelta para evitar el flujo retrógrado en el momento de la arteriotomía.
    5. Una arteriotomía se realiza mediante micro-tijeras en el cierre de la CEPA se refleja en el muñón.
    6. El calor embotado de silicona recubierto de sutura de nylon 7-0 se introduce a través de la arteriotomía de la CEPA y avanzó hasta llegar al clip de buques aplicado en ICA. Los dos puntos de sutura flojos cuello proximal de ICA se han de apretar ligeramente alrededor de la porción proximal de la ACI para evitar el flujo de sangre a través de reflujo ICA, con la atención suficiente como para no traumatizar a la pared arterial, y luego el clip de embarcación es retirada.

    El resto del procedimiento es en gran medida convergentes:

    1. La sutura de la oclusión se avanza a través de la arteria carótida interna (ACI) hacia la base del cráneo hasta una resistencia leve se siente. Una caída simultánea en el valor del flujo sanguíneo cerebral como un porcentaje (= 80%) respecto al valor basal es confirmado por flujometría láser-doppler. Los dos puntos de sutura cuello se tensan alrededor del filamento insertado.
    2. Para experimentos de isquemia cerebral transitoria, oclusión de la sutura se retira con cuidado después de 45 minutos. Este punto en el tiempo puede ser alterado por diversos fines experimentales.
    3. Después de retirar el filamento de sutura, el sitio arteriotomía se cierra para evitar el sangrado posquirúrgico. En el método de Koizumi, se trata de puntos de sutura se apriete el collar alrededor de la CCA. En la técnica de Longa, el sitio arteriotomía en la base de la CEPA se cauteriza, a continuación, los puntos de sutura en el cuello proximal ICA se aflojan y se retira para restaurar el flujo de la carótida.
    4. Para cerrar la incisión, la glándula submaxilar y SMC se establecen en el campo operatorio. Los bordes de la herida luego se aproxima con adhesivo tisular en el cuello uterino y las áreas del cuero cabelludo. Por otra parte, un producto básico reabsorbibles o metal podría ser utilizado para cerrar la herida, especialmente cuando supervivencia a largo plazo de los animales que se pretende.
    5. Después del cierre de la incisión, el animal recibe un ml de solución salina caliente por vía subcutánea como la reposición de volumen. Una dosis de los analgésicos adecuados (es decir, la buprenorfina en 0,05-0,1 mg / kg) se debe utilizar para minimizar el dolor y el malestar del animal durante el período de recuperación. El ánimal se retira de la sala de cirugía y se coloca en una jaula de recuperación de la zona caliente / para prevenir la hipotermia, con acceso gratuito, fácil de alimentos blandos y el agua.

    4. Post-Op evaluación neurológica

    Después de que el animal recobre el conocimiento total, déficits neurológicos pueden ser evaluados por una escala simple (escala de cinco puntos) de la siguiente manera 3:

    1. sin déficit observable
    2. fracaso en la prolongación pata contralateral (leve déficit neurológico focal)
    3. dando vueltas en una dirección contralateral al infarto (déficit neurológico focal moderado)
    4. cayendo en una dirección contralateral al infarto (grave déficit neurológico focal)
    5. disminución del nivel de conciencia sin movimiento espontáneo

    5. La coloración y medición cuantitativa del volumen de infarto cerebral

    1. Después de 24 horas de reperfusión MCA, el ratón superviviente se pesa, profundamente anestesiados con un 4% isoflorane y sacrificados de acuerdo con el protocolo aprobado.
    2. El cerebro se retira cuidadosamente y se colocan en una máquina de cortar el cerebro del ratón de la matriz, y el cerebro entero está coronal seccionadas a intervalos de 2 mm.
    3. Las secciones se encuentran inmersos en un 2% TTC en tampón fosfato salino (PBS) a 37 ° C durante 20 minutos. Después de la tinción TTC, área infartada se muestra como un blanco (sin teñir) los tejidos adyacentes a la de ladrillo rojo (viable) tejidos (Figura 1).
    4. Las secciones seriadas se fotografían con una cámara digital y el área de infarto se mide con el programa J imagen.
    5. El área de infarto (blanco, sin manchas), la zona del hemisferio ipsilateral (blanco y rojo ladrillo, de colores), y la zona del hemisferio contralateral (ladrillo rojo teñido), se miden para cada sección. El volumen se calcula sumando las áreas de representación en todas las secciones y se multiplica por el grosor del corte. Después de corregir el edema, el volumen de infarto se calcula de la siguiente manera 9:
      Volumen corregido del infarto (CIV),% = [volumen del hemisferio contralateral - (volumen del hemisferio ipsilateral - el volumen del infarto)] volumen del hemisferio / contralateral x 100

    6. Resultados representante

    Después de la oclusión y reperfusión de la MCA a través de la CCA a la izquierda para establecer la isquemia cerebral transitoria, los animales son sacrificados y sus cerebros seccionados coronalmente están manchadas de TTC para evaluar el volumen de infarto (Figura 1).

    figure-protocol-1
    Figura 1. TTC-manchado secciones de serie del cerebro coronal (2 mm) de los ratones sometidos a la oclusión MCA.

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Discusión

El modelo MCAO es un modelo establecido que se replica a la isquemia cerebral en especies murinas. Este modelo fue utilizado por primera vez en ratas y posteriormente adaptado a los ratones. Evitar craniectomía para eliminar la influencia de la manipulación quirúrgica de permeabilidad de la barrera sangre-cerebro y la presión intracraneal es una ventaja de esta técnica. Sin embargo, muchas variables, tales como la cepa diferencias relacionadas con la 10, el tamaño de la sutura de punta 11, la durac...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Tipo Empresa Número de catálogo Comentarios (opcional)
Los ratones machos C57BL / 6 Animal Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, EE.UU. 20-26 grs
Disección microscopio Microscopio Leica estereomicroscopio MZ6 6.3:1 captura
Iluminación de fibra óptica Iluminador TechniQuip Corp., Livermore, California, EE.UU. FO1-150
Isoflurano Anestesia Baxter Farmacia, Deerfield, IL 1001936060
SuperCut tijera Iris, recta Herramienta quirúrgica World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. 14218
Vannas micro-tijera, rectas Herramienta quirúrgica World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. 14003
Dumont pinzas de punta fina Herramienta quirúrgica World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. 503290
Buque clip de Herramienta quirúrgica World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. 14120
Desecador Alta Frecuencia 900 Herramienta quirúrgica World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. 500397
7-0 de nylon quirúrgico de sutura monofilamento Sutura Ethicon, Inc., Somerville, NJ, EE.UU. 1647G Sutura para la oclusión
7-0 suturas de seda quirúrgica Sutura Ethicon, Inc., Somerville, NJ, EE.UU. 7733G De sutura para ligadura
De silicona RTV adhesivo El caucho de silicona World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. 1571
Vetbond Adhesivo tisular 3M Company, St. Paul, MN, EE.UU. 70200746587
Puralube ungüento Vet Ungüento para los ojos Pharmaderm, Melville, NY, EE.UU.
La buprenorfina hydrochlorode Analgésicos Hospira Inc., Lake Forest, Illinois, EE.UU. NDC 0409-2012-32
Unidad de cauterio térmico World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. 501292
Periflux System 5000 TCD flujometría Perimed, Estocolmo, Suecia
BAT-12 Termómetro rectal World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU. BAT-12R
T / bomba, TP600 Manta térmica Gaymar, NY, EE.UU.
2,3,5-trifenil tetrazolio cloruro Reactivo Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, EE.UU. T8877
Los ratones del cerebro matriz cortadora Máquina de cortar el cerebro Zivic-Miller laboratorio., Inc., Allison Park, PA, EE.UU. BSMAS001-1

Referencias

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  11. Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).
  12. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).

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