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1. Set-up
- Set-up área quirúrgica, como se muestra en la figura. 1A, A '. Los componentes clave de la puesta en marcha incluye un Eppendorf FemtoJet microinyector, micromanipulador Narishige con porta-agujas, steromicroscope Leica, sistema de iluminación por fibra óptica, sistema de ECM 830 electroporación Plaza de la onda con electrodos, una almohadilla eléctrica y un vaporizador de isoflurano anestesia.
- Limpie todas las herramientas con un limpiador ultrasónico con Bransonic Metriclean2 solución de baja espuma para ultrasonidos instrumentos quirúrgicos. Esterilizar instrumentos en autoclave. Herramientas esterilizadas luego se guardan en Germex.
- Preparar jeringas con solución salina tibia estéril y estéril solución de Ringer lactato.
2. Anestesia
- Lugar de los animales dentro de una pequeña (12cm x 20cm) cámara de anestesia. El uso de un vaporizador, entrega 5% anestésico isoflurano y oxígeno a 1L/min (Fig. 1A, A '). En particular, es importante recoger escape isoflurano mediante un sistema de depuración.
- Eliminar los animales de la cámara cuando la respiración se vuelve profunda y regular. Pellizcar los dedos y las pruebas de visión reflejo de parpadeo se utilizan para garantizar la anestesia total.
- Lugar del ratón embarazadas en su espalda en la parte superior de una almohadilla térmica (37 ° C). El cojín de la calefacción por primera vez esterilizados mediante limpieza con etanol al 70%, y luego se cubre con una esterilizada, gasa sin pelusa. Use un tubo respirador y un aparato para entregar la máscara de isoflurano (2,25%) durante la cirugía.
- Inyectar la buprenorfina (0.1mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea en la piel de la nuca.
- Monitor de animales a lo largo de la cirugía para la respiración profunda y regular. El animal no debe aliento, respirar profundamente o rápidamente. Respiración rápida y superficial puede ser un signo de la anestesia ligera, y el flujo de isoflurano debería incrementarse. Si el animal empieza a jadear, reducir el flujo de isoflurano. En el caso de un paro respiratorio, apague el isoflurano, y aumentar el flujo de oxígeno hasta el animal se recupera. Reinicie el isoflurano a una concentración menor.
3. Animal preparación para la cirugía
- Tape las extremidades anteriores del animal a la almohadilla y revisar una vez más la respuesta de retracción por pellizcar la pata trasera con una pinza roma.
- El uso de un bastoncillo de algodón estéril, extender una capa gruesa de crema depilatoria (es decir, Nair) en el abdomen. En trazos firmes, garantizar el pelaje está completamente recubierto. Dejar actuar durante una media de tres minutos, comprobando de forma intermitente con una gasa estéril limpia para eliminar el vello. Moje una gasa estéril con agua estéril y limpie el abdomen hasta que todos los restos se han ido. Repita con clorhexidina (es decir, Stanhexidine) piel más limpia y más agua. Seque el abdomen con una gasa limpia y estéril.
- Esterilizar sitio de la incisión con una solución de clorhexidina (es decir, Stanhexidine), seguida de más agua estéril. Seque el abdomen con una gasa limpia y estéril. Repita este paso con etanol al 70% y un hisopo de frescos, esterilizados de algodón.
- Colocar una gasa estéril sobre el abdomen con un corte en el medio a través del cual los cuernos uterinos se retiró durante la cirugía.
4. Incisión y exposición de cuernos uterinos
- Para exponer los cuernos uterinos, primero busque la línea alba como la tenue línea debajo de la piel en la línea media. El uso de pinzas, tire de la piel de la pared abdominal y el corte de una pequeña incisión, directamente desde el abdomen hacia abajo, a mediados de la piel con unas tijeras (aproximadamente 1 cm de longitud).
- El uso de pinzas y tijeras curvas, repita el proceso con el peritoneo.
- Coloque una gasa estéril con una pequeña incisión vertical sobre la incisión y humedecer con solución salina estéril calentada.
- Diapositivas pinza en la incisión y localizar el útero. Mantenga la incisión abierta con pinzas, mientras que la eliminación de los cuernos uterinos.
- Sujete cuidadosamente el útero entre los embriones visible primera y segunda y tire de los embriones en la gasa. Retire los dos lados de los cuernos uterinos, poniendo sobre la gasa estéril y contar el número de embriones, tomando nota de cualquier resorción o "insalubres" de los embriones (por ejemplo, un tamaño más pequeño del cuerpo). Húmedos los cuernos uterinos con solución salina y con cuidado devolver la mitad del útero en el abdomen.
5. La inyección de ADN en los ventrículos
- Las agujas quirúrgicas están preparados con un extractor Sutter Micropipetas Flaming utilizando pipetas de borosilicato con capilares (Programa: calor = 750, = 30 Tire, Vel = 90, hora = 150). Usando una hoja de bisturí estéril, la punta de la aguja suavemente afeitado en un ángulo de 45 grados.
- Para cargar la aguja, pipetas Pasteur se tira a un diámetro estrecho en una llama. La boca se adjunta a la pipeta de carga para elaborar unos 10 l de 3mg/ml libre de endotoxinas ADN mezclado con verde de metilo 0,01% (nota: verde de metilo tinte permite inyecciones de ADN para ser visualizado). La aguja llena se monta en un soporte micromanipulador y unido a la inyección FemtoJet.
- Comenzando con el embrión más cercano al ovario, circular con fórcepsse utilizan para activar suavemente el embrión dentro de la decidua por lo que se coloca "cara a seguir", permitiendo que las inyecciones que se produzca en un rostral a la dirección del caudal. Una fuente de luz de fibra óptica para la iluminación se utiliza para ayudar a visualizar la línea media del cerebro embrionario, que está flanqueada por los ventrículos laterales grandes en las regiones rostral (Fig. 1B, B ').
- El embrión se mantiene en posición con las pinzas circular. La aguja se coloca por encima del útero para que el ángulo de entrada en el cerebro es de aproximadamente 45 grados. Utilizando el micromanipulador, y un movimiento rápido y constante, la punta de la aguja se inserta a través de la pared uterina y en el ventrículo lateral del embrión. Las inyecciones se dirigen hacia los ventrículos laterales, tercero ventrículo o espacio subretiniano para apuntar el telencéfalo, diencéfalo y la retina, respectivamente. Tenga en cuenta que las vesículas cerebrales embrionarias están abiertas en las primeras etapas embrionarias de tal manera que el ADN inyectado en los ventrículos laterales fluye hacia el ventrículo 3 º.
- Presione el pedal para inyectar la endotoxina libre de ADN (1-3 l) utilizando un Eppendorf FemtoJet microinyector. Una inyección de éxito es fácil de visualizar por la difusión del colorante verde de metilo a través de los ventrículos del cerebro embrionario. La aguja se retira lentamente dibujando una copia de seguridad para evitar roturas.
6. Electroporación
- El embrión inyectado (aún dentro del útero) se coloca en la gasa estéril que cubre el abdomen de la madre y mojado a fondo con solución salina caliente. Tenga en cuenta ** La adición de solución salina a la superficie de la membrana es esencial para permitir el paso eficiente de una corriente eléctrica.
- GenePaddle electrodos se utilizan para sujetar el útero después de la inyección de ADN. Cinco pulsos cuadrados eléctrico de 40-50V y 50 ms se entregan a una velocidad de un pulso por segundo utilizando un sistema de electroporación ECM8300 BTX (Fig. 1C, C ').
- Cubrir el embrión inyectado / electroporated con una gasa húmeda de protección y continuar con el embrión que viene.
- Al término de la inyección / electroporación de todos los embriones deseada, empuje con cuidado los cuernos uterinos en el abdomen (Fig. 1D).
- Retire con cuidado el cuerno uterino y empiezan de nuevo con el embrión más cercana al ovario.
7. Sutura y grapas
- Una vez que todos los embriones están de vuelta en el interior del útero, se suman a la cavidad abdominal ~ 2.3 ml de solución salina caliente.
- Para cerrar la herida, comenzar por la eliminación de la gasa en el abdomen y la identificación de los lados del peritoneo. Comenzar la sutura del peritoneo mediante la línea de negro de seda trenzada. No se recomienda el uso de sutura absorbible para este procedimiento ya que suele ser más débil y puede dar lugar a sangrado posquirúrgico y la infección. Anclar la línea en el peritoneo cercano al esternón y proceder a punto de distancia del ancla. Asegúrese de que todas las suturas son muy ajustados, y que no hay órganos subyacentes o la piel ha sido sin querer cosido en el peritoneo. Clip de la línea de sutura restante y desechar.
- Estire la piel se cerró sobre la línea de sutura con las pinzas. Por medio de 9 mm Reflex ™ piel cierre grapas, clips de la piel sobre la herida, teniendo cuidado de no básicos por debajo de la línea de sutura, o para tirar de la piel demasiado fuerte. El método preferido es el de mantener la piel y del cuerpo con pinzas, y vienen en un ángulo de 90 grados con la herramienta de primera necesidad. Continúe hasta que la herida está cerrada (aproximadamente tres grapas). Una vez terminado, asegúrese de grapas estén bien apretados presionando suavemente con la herramienta de sutura (Fig. 1D).
8. Atención postquirúrgica
- Para supervisar la recuperación anestésica, a su vez las mujeres sobre su estómago y apagar el isoflurano. Mantener la cara del animal en el interior del aparato respiratorio, a su vez de oxígeno hasta el 3% para ayudar a la recuperación de la anestesia. El animal debe ser colocado en una gasa limpia y seca en la parte superior de la almohadilla de calefacción para evitar la hipotermia.
- Mientras el animal está aturdido, se inyectan 2 ml de solución de Ringer por vía subcutánea en la piel del cuello del animal.
- Continúe sosteniendo el animal en el flujo de oxígeno durante varios minutos y las almohadillas de gasa calentamiento con el fin de despertar a los animales. Períodos cortos de movimiento de los animales deben ser observados, ya que regresa a un patrón de respiración normal. Observar durante varios minutos hasta que los animales parece consciente y despierto.
- Rocíe el abdomen de la hembra con gentamicina spray y envolver al animal en una gasa estéril.
- Transferencia del animal en una jaula estéril con ropa de cama en autoclave y la vivienda de cartón.
- Botellas de agua deben ser limpiados, esterilizados y con agua estéril. A 500 ml de agua se añaden 2 ml de antibiótico sulfametazina (25% de acciones).
- Administrar 0,05 mg / kg por vía subcutánea de la buprenorfina después de la cirugía por la mañana.
- Monitor de la hembra cerca de las primeras 24 horas después de la cirugía. Si los animales se mantienen más de 24 horas, las mujeres se trasladan a nuevas sterile jaulas en el día 2.
9. Resultados representante
Neocórtex
El neocórtex es la región del sistema nervioso central que es responsable de visuales y el procesamiento sensorio y mayor funcionamiento cognitivo. Está compuesto por neuronas de proyección glutamatérgica y interneuronas GABAérgicas que se derivan de el telencéfalo ventral y dorsal, respectivamente. Para hacer frente a los roles de diferentes genes en el desarrollo de la neocorteza, que utilizamos en la electroporación in utero a cualquiera misexpress o bloquear la expresión (es decir, a través del uso de las construcciones shRNA) de diferentes genes en el dorsal o ventral telencéfalo 1,3,4. Para misexpress genes en el telencéfalo embrionario, se utiliza un vector de expresión bicistrónico (pCIG2), que contiene un promotor de CMV-βactin potenciador y un sitio interno de entrada de ribosomas (IRES), una mayor proteína verde fluorescente (EGFP, en pCIG2) cassette, lo que permite transfectadas las células para ser detectados por epifluorescencia (Fig. 2A-C). Se utilizó esta tecnología para introducir las construcciones de expresión en el telencéfalo de E11.5 a E15.5 (datos mostrados son en E12.5;. Fig. 2). Al permitir que los embriones para desarrollar varios días después de la electroporación, que son capaces de rastrear la diferenciación y la migración de las buenas prácticas agrarias con etiqueta progenitores. A medida que avanza la diferenciación, 3 días después de la electroporación GFP + células se diferencian y migran fuera de la zona ventricular (VZ), la zona subventricular (SVZ) y zona intermedia (iz) y en la placa cortical (cp;. Fig. 2C). Si los cerebros electroporated en E12.5 se analizan después de 24 horas, podemos monitorear eventos anteriores en la maduración de progenitor y la migración neuronal por la co-etiquetado con marcadores de células progenitoras apical (es decir, Pax6;. Fig. 2A), los progenitores basal (es decir, Tbr2; . Fig. 2B) y postmitóticas neuronas neocortical (es decir, Tbr1;. Fig. 2C).
Diencéfalo
El hipotálamo está en la base ventral del sistema nervioso central y funciona como una puerta de enlace entre el sistema endocrino y el sistema nervioso autónomo. Durante el desarrollo, los múltiples núcleos que forman el hipotálamo madura diferenciarse de una zona progenitor común que las líneas de la región ventral-la mayor parte del diencéfalo embrionario. En la actualidad, las vías moleculares que regulan la proliferación de células progenitoras, la diferenciación neuronal y la formación de núcleos hipotalámicos son poco conocidos. Hemos utilizado en la electroporación in utero al objetivo de la expresión del gen de diencéfalo embrionario mediante la inyección de ADN en el ventrículo 3 º de la E12 embryos.We luego siguió la distribución de las buenas prácticas agrarias en la diferenciación de las neuronas en el E14. Con esta metodología, hemos logrado poner en la expresión de GFP en el tálamo, el pre-tálamo y el hipotálamo (Fig. 3). El análisis de las secciones coronal revela que hemos abordado con éxito la expresión de GFP en las células progenitoras que la línea de la zona ventricular del ventrículo 3 y las neuronas que migran a la zona del manto para formar núcleos (Fig. 3B)
Retina
La retina es la capa de nervios del ojo, responsable de convertir los fotones de luz en impulsos eléctricos transmitidos al cerebro. Se desarrolla como una evaginación del diencéfalo embrionario, y por lo tanto, se deriva del tubo neural. La retina neural se desarrolla a partir de un compartimento apical progenitor que se encuentra adyacente al espacio subretiniano, una cavidad que separa el ojo del mesénquima de la cabeza. Orientación construcciones de ADN de los progenitores la retina por lo que requiere que las inyecciones se realizan en un área de blanco pequeño. Utilizando micromanipuladores, hemos logrado objetivos con éxito esta pequeña área en los embriones de E13.5 a E15.5 (que se muestra es E15.5 electroporations de PCIC con el reportero mCherry; Fig. 4.). Si electroporated retinas se examinan 24 horas después de la transfección, se observa que la mayoría de las células + mCherry se encuentran en la capa exterior neuroblast (onbl), donde los progenitores se encuentran dividiendo, y no en la capa de células ganglionares de la retina (gcl; imagen insertada), donde las células postmitóticas localizar.
Figura 1. Introducción a la electroporación en el útero de configuración y metodología. (A) Los componentes clave de la cirugía de configuración incluyen un Eppendorf FemtoJet microinyector (1), micromanipulador Narishige con soporte de la aguja (2), steromicroscope Leica (3), iluminación de fibra óptica sistema (4), ECM 830 Sistema de la plaza de electroporación de onda con los electrodos (5) y el cojín de la calefacción (6). (A ') El animal se anestesia con un vaporizador de isoflurano anestesia. (B, B ') En pocas palabras, después de la anestesia, los cuernos uterinos están expuestos y el ADN mezclado con verde rápido se inyecta en el cerebro embrionario vesículas. Una inyección de éxito se visualiza mediante el seguimiento de la rápida tinte verde (B '). (C, C) Después de que el ADN es inyectado con éxito, los electrodos de paletas se colocan a ambos lados del útero, positicañoning el embrión de modo que el ADN se estira hacia el polo positivo en la región del cerebro de la elección. (D, D ') Una vez que todos los embriones son inyectados deseado, el útero es empujado hacia atrás en el abdomen (D), el peritoneo se sutura, y la piel se grapa (D'). La mujer embarazada entonces se permite la recuperación y las crías de electroporación se recogen en los puntos de tiempo deseado.
Figura 2. Ejemplo representativo de la electroporación telencefálicas dorsal. (AC) Fotomicrografía de una sección coronal a través de un telencéfalo E13.5 dorsal electroporated en E12.5 con pCIG2. Electroporated células GFP + son analizados por su expresión de marcadores de células progenitoras apical (Pax6 +, rojo, A), los progenitores basal (Tbr2 +, rojo, B) y las neuronas postmitóticas (Tbr1 +, rojo, C). cp, placa cortical; svz, zona subventricular, vz, zona ventricular.
Figura 3. Ejemplo representativo de la electroporación diencefálico. (A) Un punto de vista ventral del cerebro de un E14 que ha sido electroporated en E12 con pCIG2. GFP epifluorescencia es visible en el tálamo, el pre-tálamo y el hipotálamo, lo que demuestra la expansión de la microinyección pCIG2 plásmido en todo el ventrículo 3 º. (B) Microfotografía de la sección coronal a través del cerebro electroporación, que muestra la migración de las células GFP + fuera de la zona ventricular y en la zona del manto, donde los núcleos del hipotálamo se forma. 3V, tercer ventrículo, T, el tálamo, Hy, el hipotálamo, mz, zona del manto, Tel, telencéfalo, PreT, prethalamus; vz, zona ventricular.
Figura 4. Ejemplo representativo de la electroporación de retina. Sección coronal a través de un ojo E16.5 electroporación con PCIC en E15.5 que muestra la acumulación de células mCherry + en la capa exterior de los neuroblastos y no en Brn3b + en las células ganglionares de la retina en la capa de células ganglionares. La inserción es una imagen de mayor aumento de la zona de caja. gcl, ganglionares de la retina la capa de células, le, lentes, capa onbl, neuroblast exterior, re, la retina.