Tregs son supresores potentes del sistema inmune. Hay una falta de marcadores de superficie única para definir, por lo tanto, las definiciones de células T reguladoras son principalmente funcionales. A continuación se describe un optimizado In vitro Prueba capaz de identificar el desequilibrio inmunológico en personas en riesgo de desarrollar DT1.
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Artículo de método
Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células T reguladoras (Tregs) son mediadores críticos de la tolerancia inmunológica a antígenos propios. Además, son reguladores esenciales de la respuesta inmune después de una infección. A pesar de los esfuerzos para identificar marcadores de superficie única en Tregs, la única característica única es su capacidad para suprimir la proliferación y la función de las células T efectoras. Si bien es claro que sólo en los ensayos in vitro se pueden utilizar en la evaluación de la función Treg humanos, esto se vuelve problemático cuando se evalúen los resultados de los estudios transversales en las células sanas y células aisladas de pacientes con enfermedades autoinmunes (como la diabetes tipo 1-DT1) necesitan para ser comparados. Hay una gran variabilidad entre laboratorios en el número y tipo de células T de respuesta, la naturaleza y la fuerza de la estimulación, Treg: ratios de respuesta y el número y tipo de células presentadoras de antígeno (APC) que se utiliza en humanos en ensayos de supresión in vitro. Esta variabilidad hace que la comparación entre los estudios de medición de la función Treg difícil. El campo de las necesidades de Treg un ensayo de supresión estándar que funcione bien con los sujetos sanos y aquellos con enfermedades autoinmunes. Hemos desarrollado un ensayo de supresión in vitro que muestran muy poca variabilidad intra-ensayo en la estimulación de células T aisladas de voluntarios sanos en comparación con sujetos con base destrucción autoinmune de las células pancreáticas β-. El objetivo principal de esta obra es describir un ensayo in vitro supresión humanos que permita la comparación entre grupos de sujetos diferentes. Además, este ensayo tiene el potencial para delinear una pequeña pérdida en la función nTreg y anticiparse a una mayor pérdida en el futuro, por lo tanto la identificación de los sujetos que podrían beneficiarse de la terapia inmunomoduladora preventivas 1. A continuación, ofrecemos una descripción detallada de los pasos involucrados en este procedimiento. Esperamos contribuir a la estandarización de la prueba de supresión in vitro utilizado para medir la función Treg. Además, le ofrecemos este ensayo como una herramienta para reconocer un estado inicial de desequilibrio inmunológico y un biomarcador potencial funcional de DT1.
Protocolo
1. Antes de la creación de un ensayo de supresión, es necesario cuentas de abrigo tosylactivated con anti-CD3 humano (clon UCHT1, 1μg/ml concentración final) para la estimulación de células y después comprobar si las cuentas están recubiertas de manera eficiente mediante la creación de un ensayo in vitro de la proliferación de uso humano las células T
- Tomar 1 ml de M-450 cuentas de tosylactivated vial original, lugar en soporte magnético y espera hasta que todas las cuentas se han adherido a la pared del tubo. Retire el tubo de amortiguación, mientras que todavía está en el soporte magnético. Tome el tubo del soporte magnético y añadir 1 ml de buf....
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Discusión
Como la única característica única de células T reguladoras, la función de supresión debe ser probado de forma fiable y uniforme entre los sujetos en las diferentes fases de desarrollo de la enfermedad dentro de la misma y entre los diferentes estudios. Le ofrecemos los detalles de la prueba de supresión desarrollado en nuestro laboratorio como nuestra contribución a la normalización de este ensayo. En nuestro estudio de optimización extensa, hemos determinado que la estimulación de células T con anti-CD3 humana revesti.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por Max McGee Centro Nacional de Investigación para Menores Diabetesat Colegio Médico de Wisconsin y el Instituto de Investigación de Niños de Wisconsin. Los financiadores no participó en el diseño del estudio, la recopilación de datos y análisis, o la preparación del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo o instrumento | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham Pharmacia Biotech | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | Gibco | 14190-144 | |
| Azul de tripano | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbolas | Miltenyi | 130-045-101 | |
| Separación de los pre-filtros | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS columna | Miltenyi | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-CD4 humano APCCy7 (clon RPA-T4) | BD Pharmingen | 557852 | |
| Anti-humano CD25-PE (clon M-A251, IL-2Rα) | BD Pharmingen | 555432 | |
| Anti-humano CD8-FITC (clon RPA-T8) | BD Pharmingen | 555366 | |
| Anti-humano CD14-FITC (clon M5E2; receptor de LPS) | BD Pharmingen | 555397 | |
| Anti-humano CD32-FITC (clon FLI8.26; FcγR de tipo II) | BD Pharmingen | 555448 | |
| Anti-humano CD116-FITC (clon M5D12, GM-CSFRα cadena) | BD Pharmingen | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-CD3 humanos | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Casero | 0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Casero | PBS/2mM EDTA / 0,1% BSA pH 7,4 | |
| Buffer3 | Casero | 0,2% de BSA pH 8,5 Tris/0.1 | |
| Completa los medios de comunicación RPMI | Casero | Medio RPMI 1640 glutamina 2 mM L-5 mM HEPES 100 U / mg / ml penicilina / strept 0,5 mM piruvato sódico | |
| [3 H] timidina | Perkin Elmer | NET027Z005MC | |
| humanos agrupados suero AB | Atlanta Productos Biológicos | S40110 | |
| Placa de la cosecha multipantalla | Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | Perkin Elmer | 6013621 |
Referencias
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R.
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