Basados ​​en células de calcio de ensayo para el medio a cribado de alto rendimiento de las funciones del PRT canal utilizando FlexStation 3

Resumen

Este video ofrece un protocolo detallado para estudiar el perfil farmacológico de humanos TRPA1 canales a través de FlexStation 3. El protocolo cubre los detalles de la preparación de la célula, la carga de tinte y el funcionamiento del lector de microplacas, FlexStation 3.

Resumen

El FlexStation Molecular Devices "3 es una mesa de trabajo multi-modo de lector de microplacas capaz de medir la fluorescencia automatizado de múltiples placas. Es ideal para medianas y de alto rendimiento de las pantallas en el ámbito académico. Tiene un módulo de transferencia de fluidos integrado equipado con una pipeta de canales múltiples y la máquina lee una columna a la hora de controlar los cambios de fluorescencia de una variedad de reactivos fluorescentes. Por ejemplo, FlexStation 3 se ha utilizado para estudiar la función de Ca ^{2 +-permeables} los canales de iones y proteínas G-receptores acoplados mediante la medición de los cambios intracelulares de Ca ^{2 +} libre los niveles. Transitoria receptor potencial (TRP) los canales son una gran familia de canales de cationes no selectivos que juegan un papel importante en muchas funciones fisiológicas y fisiopatológicas. La mayoría de los canales TRP son el calcio permeable e inducir la entrada de calcio a la activación. En este video, se demuestra la aplicación de FlexStation 3 para estudiar el perfil farmacológico de los canales TRPA1, un sensor molecular de numerosos estímulos nocivos. HEK293 transitoria o estable expresando humanos TRPA1 canales, que se cultiva en placas de 96 pozos, se cargan con una Ca ^{2 +} sensibles tinte fluorescente, Fluo-4, y en tiempo real los cambios de fluorescencia en estas células se midió antes y durante la aplicación de un agonista de la TRPA1 utilizando el modo de flexión de la FlexStation 3. El efecto de un antagonista de los supuestos TRPA1 también fue examinado. Los datos se transfieren desde el software Pro SoftMax para construir relaciones de concentración-respuesta de TRPA1 activadores e inhibidores.

Protocolo

1. Preparaciones de células en placas de 96 pozos

Para las células HEK293 transitoria trasfected con cDNA TRPA1 humanos

1. HEK293 células se cultivan para uno o dos días en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) que contiene 4,5 mg / ml de glucosa (Thermo Scientific, SH3002201), suplementado con 10% inactivado por calor suero fetal bovino (Invitrogen, 16000-044), 50 unidades / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina (Invitrogen, 15140-163). En el día de la transfección, la densidad celular debe llegar a un 70-90%.
2. Escudo placas de 96 pozos con la pipeta 50 l poli-L-ornitina (Sigma P3655, 20 mg / ml en ....

Discusión

Intracelular de Ca ^{2 +} juega un papel importante en muchas condiciones fisiológicas y patológicas, como la liberación de neurotransmisores (3), potencial de acción cardíaco (4), la contracción de las células musculares (5), la transducción de señal de celular (6-7), y la muerte celular excitotóxica ( 8). La medición de Ca ^{2 +} intracelular niveles de ayuda a dilucidar los cambios funcionales de Ca ^{2 +-permeables} los canales en la membrana plasmática o organelos intracelulares y la contrib.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
FlexStation 3	Molecular Devices	FLEX3
96-Bueno, Consejos FlexStation Pipet	Molecular Devices	9000-0912
Placas de 96 pozos	Greiner Bio-One	655090
96-Bueno, claro placas de fondo plano	Costar	3595
DMEM	Invitrogen	12430-104
Opti-MEM	Invitrogen	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14202
PluronicF-127	Invitrogen	P3000MP
Poli-L-ornitina	Sigma	P36551
probenecid	Sigma	P8761
Albúmina de suero bovino	Sigma	A9418