La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Summary

Monocapas auto-ensambladas (SAMs) formado por largas cadenas de alcanos tioles en oro proporcionan sustratos bien definidos para la formación de los patrones de proteínas y el confinamiento de la célula. Impresión por microcontacto de hexadecanethiol con un polidimetilsiloxano (PDMS) sello seguido por el relleno con un glicol terminada alcano tiol monómero produce un patrón en el que las proteínas y las células de absorber sólo a la región hexadecanethiol sellado.

Abstract

Impresión por microcontacto proporciona un método rápido y altamente reproducible para la creación de sustratos bien definidos patrones. Mientras que ^una impresión por microcontacto pueden ser empleadas para imprimir directamente a un gran número de moléculas, incluyendo proteínas, DNA ^{2, 3} y silanos, ⁴ la formación de uno mismo -ensambladas monocapas (SAM) de largo tioles cadena de alcanos en el oro proporciona una forma sencilla de limitar las proteínas y las células a patrones específicos que contienen las regiones adhesiva y resistente. Esta detención se puede utilizar para controlar la morfología celular y es útil para examinar una serie de preguntas en proteínas y biología celular. Aquí se describe un método general para la creación de patrones de proteínas bien definido para los estudios celulares ⁵ Este proceso consiste en tres pasos:. La producción de un maestro de modelado usando fotolitografía, la creación de un sello de PDMS, y microcontacto impresión de un oro sustrato recubierto. Una vez modelados, los sustratos de cultivo de células son capaces de limitar las proteínas y / o células (células primarias o líneas celulares) para el patrón.

El uso de la química monocapa auto-ensambladas permite un control preciso sobre las regiones adhesivas con dibujos de proteína / celular y de las no-adhesivo, lo que no se puede lograr utilizando estampación directa de proteínas. Hexadecanethiol, la larga cadena alcano tiol utilizado en la etapa de impresión microcontacto, produce una superficie hidrofóbica que fácilmente absorbe las proteínas de la solución. El glicol de terminación tiol, que se utiliza para rellenar las zonas no impresas del sustrato, crea una monocapa que es resistente a la adsorción de proteínas y por lo tanto el crecimiento celular. ⁶ Estos monómeros tiol produce monocapas altamente estructurado que definen con precisión las regiones del sustrato que pueden apoyar adsorción de proteínas y el crecimiento celular. Como resultado, estos sustratos son útiles para una amplia variedad de aplicaciones, desde el estudio del comportamiento ⁷ intercelular a la creación de la microelectrónica. ⁸

Mientras que otros tipos de química monocapa se han utilizado para los estudios de cultivos celulares, incluyendo el trabajo de nuestro grupo con trichlorosilanes para crear patrones directamente sobre sustratos de vidrio, ⁹ monocapas patrón formado por tioles alcano en el oro son claros para prepararse. Por otra parte, los monómeros utilizados para la preparación de monocapa están disponibles comercialmente, estable, y no requieren almacenamiento o manipulación en atmósfera inerte. Sustratos patrón preparada a partir de alcanos tioles también pueden ser reciclados y reutilizados varias veces, el mantenimiento de confinamiento celular. ¹⁰

Protocol

1. Preparación del Maestro patrones (Figura 1)

1. El centro de la oblea de silicio en el spin-aplicador y enjuagar la lámina con acetona durante la fase inicial del programa de rotación de dos ciclos en la Tabla 1. La acetona se evapora durante la segunda etapa del programa spin dejando una hostia limpia y seca.
2. Aplicar aproximadamente 1 ml AZ9245 fotosensible / a (de diámetro) para el pan y el giro escudo con las condiciones descritas en la Tabla 1.
3. Soft-hornear la oblea fotosensible recubierto a 110 º C durante 2 m con una placa de alta uniformidad.
4. Photopattern el sustrato utilizando un sistema de escritura directa fotolitogra....

Discussion

Una serie de cuestiones que pueden surgir en la producción litográfica de la maestra utilizado para la creación de marca de PDMS. Subexposición de los resultados de obleas resistencia con recubrimiento en los patrones de nebuloso y confuso y la sobreexposición de los resultados de obleas resistencia con recubrimiento en las características de ampliación o no. En general, los maestros con tamaños grandes (> 10 mm) son relativamente fáciles de patrón y se desarrollan, mientras que maestros con características más peque.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
De obleas de silicio	Wafer Recuperar Servicios		2 pulgada
Giro aplicador / placa caliente	Brewer Ciencia	Cee 200CB spin-Bake sistema
AZ9245 fotosensible	Mays Chemical Company	105880034-1160
Escritura directa fotolitografía sistema	Microtech srl	LW325 LaserWriter sistema
Máscara de alineador	HTG	3h
AZ Autor 400K	Mays Chemical Company	105880018-1160
Sylgard de silicona 182 Kit de elastómero	Dow Corning
25 mm no. Un cubreobjetos de vidrio redondo	VWR	16004-310
Plasma Oxidante	Diener	Femto
Piezas de titanio Kamis	Incorporado		99,95%
Pellets de oro	Kamis Incorporated		99,999% de pureza
Haz de electrones del evaporador	Kurt J. Lesker	PVD 75 Thin Film sistema de deposición de	con el accesorio de haz de electrones
Hexadecanethiol	Alfa Aesar	A11362
1-mercaptoundec-11-il) tetra (etilenglicol)	Sigma Aldrich	674508
Etanol	Pharmco-aaper	111000200	200 pruebas, absoluta
Parafilm	VWR	52858-000
DPBS	VWR	4500-434	Sin el calcio y el magnesio
Ratón laminina I	VWR	95036-762
La fibronectina de plasma humano	Invitrogen	33016-015
AlexaFluor ® 647 de ácido carboxílico, éster de succinimidilo	Invitrogen	A-20006
MitoTracker Red 580	Invitrogen	M22425
AlexaFluor ® 350 de ácido carboxílico, éster de succinimidilo	Invitrogen	A-10168
Anticuerpos anti-laminina	Fisher Scientific	AB2034MI