Summary
En enkel och bekväm metod för att fastställa omfattningen av gapet korsningen spårämne kopplingen mellan näthinnans nervceller beskrivs. Denna teknik möjliggör en för att undersöka funktionen hos de elektriska synapser mellan nervceller i den intakta näthinnan under olika belysning förhållanden och vid olika tider på dygnet.
Abstract
Förutom kemisk synaptisk transmission kan nervceller som är sammankopplade genom gap junctions kommunicerar också snabbt via elektriska synaptisk transmission. Ökad tyder på att gap-junctions inte bara tillåter elektrisk ström flöde och synkrona aktivitet mellan sammankopplade eller kopplade celler, men att styrka eller effekt av elektrisk kommunikation mellan kopplade celler kan anpassas i stor utsträckning 1,2. Dessutom medger den stora inre diameter (~ 1,2 nm) av många kanaler gap junction inte bara elektrisk ström, men också spridning av intracellulära signalmolekyler och små metaboliter mellan sammankopplade celler, så att gap-junctions kan också medla metabola och kemisk kommunikation . Styrkan i gapet Junktional kommunikation mellan nervceller och dess modulering av signalsubstanser och andra faktorer kan studeras genom att samtidigt elektriskt inspelning från kopplade celler och genom att fastställa than omfattningen av spridningen av spårämne molekyler, som är klyftan korsningen genomsläppliga, men inte membranet genomsläppliga efter jontoforetiskt injektion i enstaka celler. Dock kan dessa förfaranden vara extremt svårt att utföra på nervceller med små somata i intakt nervvävnad.
Ett flertal studier på elektriska synapser och modulering av elektrisk kommunikation har genomförts i ryggradsdjur näthinnan, eftersom varje av de fem näthinnans neuron typer är elektriskt sammankopplade med gap junctions 3,4. Ökande bevis har visat att dygnsrytm (24-timmars) klockan i näthinnan och förändringar i ljus stimulering reglerar gap junction koppling 3-8. Till exempel har de senaste arbete visat att näthinnans dygnsrytm klockan minskar koppling gap junction mellan tappar och stavar celler fotoreceptor under dagen genom att öka dopamin D2-receptorn aktivering och dramatiskt ökar rod-cone koppling på natten genom att minska D2-receptorn aktiveras Här presenterar vi en enkel metod för att bestämma omfattningen av gapet korsningen spårämne kopplingen mellan näthinnans nervceller under olika belysning förhållanden och vid olika tider på dygnet. Denna nedskärning laddning teknik är en modifiering av skrapa lastning 9-12, som är baserad på färg lastning och spridning via öppna kanaler gap junction. Skrapa lastning fungerar bra i odlade celler, men inte i tjocka skivor som intakta näthinnor. Snittet laddning Tekniken har använts för att studera fotoreceptor kopplingen intakt fisk och däggdjur näthinnor 7, 8,13, och kan användas för att studera kopplingen mellanandra retinal nervceller, som beskrivs här.
Protocol
1. Intakt neural retina förberedelser för guldfiskar, möss och kaniner
- Utför alla följande steg, inklusive de som beskrivs i "2) Klipp-loading", under konstant omgivande (bakgrund) belysning. Observera att för tillämpningen av detta protokoll, är de förfaranden som beskrivs som utförs i konstant mörker (på väldigt mörka (dvs "scotopic") villkor, dvs ≤ 0,0001 lux) med hjälp av mörkerseende IR-glasögon, men andra högre intensitet konstant omgivande belysning kan användas i stället för att bestämma effekten av andra nivåer av omgivande belysning på gap junction spårämne koppling.
- Dark-anpassa försöksdjur (guldfiskar, mus eller kanin) i minst 1 timme före operationen.
- Som tidigare beskrivits 7, djupt söva guldfisk genom att placera dem i tricaine methanesulfonate (MS222, 150 mg / L buffrad (natriumbikarbonat innehåller) akvarium vatten), och djupt söva möss med ketamin (100 mg/ Kg, ip) och rompun (10 mg / kg ip). Djupt söva kaniner med uretan (laddningsdos: 2,0 g / kg, ip) och även använda lokala intraorbital anestesi (2% Xylocain), som beskrivits tidigare 8. Alla experimentella undersökningar som omfattar skötsel och användning av djur bör utföras i enlighet med federala riktlinjer och skall granskas och godkännas av lokala universitetet djuromsorg och kommittéer användning. (Obs!. I försöken som beskrivs här, alla experimentella undersökningar som omfattar skötsel och användning av fisk möss och kaniner utförts i enlighet med NIH riktlinjer och har granskats och godkänts av Ohio State University Institutional Animal Care och användning kommittén)
- För fisk, möss och kaniner, efter enucleation, ta bort den främre delen av varje ögongloben. Sedan placera en bit filtrerpapper ovanpå den bakre delen av ögat och invertera filterpapper och ögat, så att filtret papperet under den bakre delen av ögat. Sedan, med finpincett dissekera den intakta neurala näthinnan från den bakre delen av ögat genom att försiktigt skala bort pigmentepitel / koroidea / sklera, som är knutna till varandra, från neurala näthinnan, som är knuten till filtrerpapper. Eftersom detta är gjort, klippa av synnerven med fina fjädrande sax. Den neurala näthinnan, orienterade fotoreceptor uppåt, nu bör bifogas filtrerpapper och separeras från resten av ögat.
2. Cut-laddning
- Sänk ner näthinnor i syresatt Ringers lösning (tabell 1) i en 6-brunnar (~ 5 ml / brunn) i 30 min under konstant omgivande (bakgrund) belysning (t.ex. på väldigt mörka (dvs "scotopic") förhållanden) med eller utan ett test drog. Behåll fisk näthinnor i syresatt (5% CO 2 / 95% O 2) bikarbonat-baserat Ringer vid 22 ° C genom att täta 6-brunnar med parafilm och underhålla mus och kanin näthinnor vid 36 ° C i 5% CO 2 / 95% O
- Förbered spårämne lösningen (vanligen 100 mikroliter) genom att lösa neurobiotin (0,5%), en biotinylerad molekyl, i Ringer lösning omedelbart före skär genom näthinnan. Observera att 0,5% Rhodamine dextran (hög (> 10.000) MW) kan läggas till lösningen. Tack vare sin höga molekylvikt, passerar Rhodamine dextran inte gap-junctions och bara etiketter celler som har skadats av snittet. Som visas i figur. 3, är detta ett bra sätt att skilja celler som har ackumulerats neurobiotin eftersom de har skadats, från dem som har samlat de spårämne genom diffusion genom gap junctions.
- Placera neurobiotin lösningen på ett glas (eller plast) petriskål, knacka på filtrerpapper, som näthinnan sitter, på en pappershandduk för att avlägsna överflödig Ringer, doppa ett rakblad (eller annan vass kniv) i neurobiotin lösning och den gör ett radiellt skär genom näthinnan och filterpapper. Om du vill kan distanser användas så att snittet sker genom näthinnan, men inte filtrerpapper. Snittet bör inriktas vinkelrätt mot näthinnan ytan. Doppa rakblad i neurobiotin lösningen igen och skär näthinnan en andra gång. Upprepa upp till 4 snitt per näthinnan (se bild. 1). Använd en dissekera mikroskop när du gör rakblad skär genom mus och andra små näthinnor.
- Som visas i figur. 1, sänk näthinnan igen i färsk Ringer medium, med eller utan testa droger, med hjälp av en 6-platta och (5 ml Ringer / brunn). Inkubera näthinnan i 15 min för att möjliggöra lastning och diffusion.
- Tvätta tre gånger i 5 minuter vardera med färska Ringer medium med eller utan testa drogen.
- Fäst näthinnan med 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffert (PBS, pH 7,4) under 1 timme vid RT.
- Tvätta med 0,1 M PBS över natten vid 4 ° C.
- Följande dag, reagerar wed 2% streptavidin-Alexa 488 (slutlig koncentration 10 mikrogram / ml) i 0,1 miljoner PBS + 0,3% Triton X-100, och hålla över natten vid 4 ° C.
- Tvätta tre gånger i 10 min med vardera 0,1 miljoner PBS vid RT
- I PBS, lossa näthinnan från filterpapper och sedan, med hjälp av en fin pensel, placera näthinnan, orienterade fotoreceptor uppåt, på en bild.
- Försiktigt fäste med Vectashield monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
- Ta bilder med en laserskanning konfokalmikroskop (t.ex. Zeiss 510 META) på samma förstoring, upplösning och inställningar för varje experimentella villkor, så att du kan jämföra effekterna av olika experimentella förhållanden (t.ex. testa läkemedel, belysning etc.) som påverkar omfattningen av gap junction spårämne koppling (bild 2A-C och Bild. 4A-C). Även om en enda bild kan innehålla alla märkta celler, rekommenderas det att du samlar ett z-stack i området av intresse och komprimera den till en endabild.
3. Kvantifiering av spårämne kopplingen med ImageJ
- I LSM bildläsaren, öppna bilden, klickar du på Exportera och spara bilden som en TIF-16 bitars INTE komprimerad fil. Skala baren bör ingå i detta TIF-bild.
- Använda NIH ImageJ mjukvara, mäta fluorescens intensiteten av Alexa-488-märkta neurobiotin från låg-förstoring bilder av hela berget näthinnor. Öppna TIF filen med ImageJ programvaran och sedan dra en rät linje som motsvarar skalan baren. Gå till ANALYSERA, SET Skala och skriv in de kända avstånd och längdenhet, klicka på OK. Nu mätresultat kan presenteras i kalibreras enheter, t.ex. millimeter.
- Välj område av intresse att använda den rektangulära markeringsverktyget. Toppen av fluorescens bör placeras vid vänstra kant ditt val. Se till att det inte finns någon fluorescenssignalen nära den högra kanten. Om inte, vrid den aktiva bilden (bild, vrid sedan).
- Klicka påAnalysera och PLOT PROFIL. Du bör se en kurva med en exponentiellt avtagande från vänster till höger.
- Klicka på Kopiera på popup-fönstret och klistra in den i Excel. Nu ser du två kolumner som visar avståndet från klippa (vänster kolumn) och fluorescensintensiteten som en funktion av avståndet från snittet (höger kolumn).
- Dela varje RAW-fluorescens värde genom att det maximala fluorescens värde för att få den relativa fluorescensintensiteten.
- Kopiera två kolumner som motsvarar avståndet från klippa (X) och den relativa fluorescensintensitet (Y) och sedan klistra in dem i Origin mjukvara.
- Montera med exponentiellt avtagande # 1 funktion (Fig. 2D och Fig. 4D.), Som är i form:
Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ)
där Y är den relativa fluorescensintensiteten är Y o bakgrundsfluorescens är Y max den maximala relativa fluorescens, är λ SPACE (längd) konstant och x är avståndet från snittet. - Jämför utrymmet konstant (λ) värden vid olika experimentella förhållanden med t-test eller ANOVA (Fig. 2E och bild. 4E). Observera att alternativa tekniker för kvantifiering har beskrivits av andra 13,14.
4. Representativa resultat
Representativa exempel på fotoreceptor cell spårämne koppling som bestäms av cut-lastning presenteras i figurerna 2 och 3 (fisk) och Figur 4 (kanin). Konfokala bilder är tagna med samma inställningar för jämförelse (bild 2A-C och Bild. 4A-C) och fluorescensintensiteten var ritas som en funktion av avståndet från snittet och monteras av den exponentiella funktionen som visas i nr 3,8 ovan (Fig. 2D och figur. 4D). Utrymme konstanta värden för varje tillståndvisas i figurerna 2E och 4E, som visar att omfattningen av gapet trafikplats spårämne koppling kan kvantifieras med hjälp av cut-lastning teknik. Dessutom är resultaten mycket reproducerbara. Användning av cut-lastning tekniken som ett sätt att kvantifiera omfattningen av gapet korsningen spårämne kopplingen är även godkänd av konstaterandet att fluorescensintensiteten avtar exponentiellt som funktion av avstånd från skär i samtliga fall undersöks 7,8 (se även figurerna. 2D-och 4D här), vilket indikerar att neurobiotin in i fotoreceptorer via rakkniv skär och inte från andra retinala webbplatser. Dessutom kvalitativt likartade dag / natt skillnaden i fotoreceptor cell spårämne koppling observerats i guldfisk med spårljus injektioner i enstaka kottar och med cut-lastning 7 bestyrker cut-lastning som ett relativt korrekt sätt att mäta omfattningen av fotoreceptor koppling.
Cut-loading Tekniken kan också användas för att undersöka andra typer av elektriska synapser i näthinnan. Till exempel visar Figur 5 att kaninen A-typ (fig. 5A) och B-typ (Fig. 5B) horisontella celler uppvisar homolog spårämne koppling följande cut-lastning och spridning av neurobiotin under mörka anpassade förhållanden.
| Compound | Fisk | Mus | Kanin |
| NaCl | 130 | 120 | 117 |
| NaHCO 3 | 20 | 25 | 30 |
| NaH 2 PO 4 | - | 1 | 0,5 |
| KCL | 2,5 | 5 | 3,1 |
| Glukos | 10 | 10 | 10 |
| MgCl 2 | 1 | - | - |
| MgSO 4-7H 2 O | - | 1 | 1,2 |
| Glutamin | - | 0,1 | 0,1 |
| CaCl 2 | 0,7 | 2 | 2 |
Tabell 1: Sammansättning av Ringer-lösningar för guldfiskar, mus och näthinnor kanin. Halterna presenteras i mm. Ringer lösningar är bubblade med 5% CO 2 / 95% O 2 och bibehölls vid 22 ° C (fisk) eller 36 ° C (däggdjur). "-": Inte i Ringer för denna art.
Figur 1:. Flödesschema som visar cut-lastning förfarande. Efter isolering of den intakta neurala näthinnan har flera radiella nedskärningar som gjorts av ett blad som först doppats i 0,5% neurobiotin lösning. Näthinnan var inkuberas spårämne lastning och spridning, och sedan tvättas innan fixeringen med 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 miljoner fosfatbuffert (PB). Tracer kopplingen har undersökts med hjälp av streptavidin-konjugerad Alexa-488.
Figur 2. Dag-natt skillnad i fotoreceptor spårämne koppling i Goldfish avslöjas av cut-lastning teknik. Fotoreceptor cell gap junction neurobiotin spårämne koppling var omfattande på natten (B) och på dagen efter tillämpning av spiperone (10 M), en selektiv dopamin D 2-receptorantagonist (C), men inte i dag under kontroll förhållanden (A). D) Normaliserad relativa fluorescerande intensitet som funktion av avståndet från de delar (visas med pilar i AC). E) Space konstant ValUES från data i D och andra experiment (n = 4). *** P <0,001.
Figur 3. Ett representativt exempel som visar fluorescens i ljusmätare cellager en mörk anpassad guldfisk näthinnan på natten följande cut-laddning med en lösning av både neurobiotin och Rhodamine dextran. Rhodamine dextran (visas i rött), som inte diffus genom öppna kanaler gap junction grund av sin höga molekylvikt (> 10,000 MW), endast märkta celler nära snittet. Däremot kan neurobiotin (visas i grönt) sprids genom gap junctions och ses i ljusmätare celler långt från snittet. Placeringen av snittet indikeras av pilen i varje panel. Skala bar: 200 ìm.
Figur 4. Day-Night skiljerinflytande i fotoreceptor spårämne kopplingen kanin näthinnan avslöjas av cut-lastning teknik. Fotoreceptor cell gap junction neurobiotin spårämne koppling var omfattande på natten (B) och på dagen efter tillämpning av spiperone (10 mikroM) (C), men inte på dagen under kontroll förhållanden (A). I AC är vinkelrät utsikt över 3D-rekonstruktion av kanin fotoreceptorer nära den skurna visas. D) Normaliserad relativa fluorescerande intensitet som funktion av avståndet från nedskärningar. E) Space konstanta värden från data i D och andra experiment (n = 3). *** P <0,001.
Figur 5. Cut-lastning avslöjar att mörka anpassade är kanin horisontella celler spårämne kopplade. Både A-typ (A) och B-typ (B) horisontella celler i mörka anpassad-kanin näthinnor uppvisade homolog neurobiotin spårämne koppling.
Discussion
Cut-lastning metoden som beskrivs här är en nyttig och enkel teknik för att fastställa omfattningen av gapet korsningen spårämne kopplingen mellan näthinnans nervceller under olika belysning förhållanden och vid olika tider på dygnet. Fördelar med denna teknik är möjligheten att kvantifiera omfattningen av gapet korsningen spårämne kopplingen mellan nervceller i intakta näthinnan vävnaden under olika belysning villkor under dagen och natten och att göra det för kopplade nervceller som har liten diameter somata. Begränsningar av tekniken i studien av gap-junctions i intakt vävnad delas in i två generella kategorier. Första kan spårämne spridning genom öppna gap-junctions vara relativt svårt att observera på grund av a) den lilla diameter eller avgiften i samband med öppna kanaler och b) de relativa volymerna av kopplade cellens 1,14,15. Det är, spårämne diffusion från en liten cell till en större cell eller grupp av kopplade celler, kompared till spårämne diffusion från en större cell till en mindre cell, kan vara svårare att upptäcka på grund av spårämne utspädning. För det andra, under vissa fysiologiska förhållanden, kan omfattningen av spårämne diffusion genom gap junctions i intakt vävnad inte korrekt återspeglar styrkan i gapet Junktional konduktans på grund av skillnader i värmeledningsförmåga små elektriska strömförande joner, jämfört med permeabilitet relativt stora spårämne molekyler 1,14,15. I allmänhet visar tecken på spårämne koppling starkt närvaron av funktion, öppna kanaler gap junction, men under vissa fysiologiska förhållanden kan spårämne spridning inte inträffar eller observeras även om elektrofysiologiska inspelningar tyder på förekomsten av en fungerande, öppna gap junctions.
Det verkar troligt att cut-lastning tekniken kan också användas för att undersöka omfattningen av gapet korsningen spårämne kopplingen mellan nervceller i intakt vävnad från andra delar av centrala nervsystemetTEM.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av NIH bidrag EY005102 till SCM och EY018640 för HLR
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | 150 mg/L of buffered fish tank water |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | 2 g/kgloading dose |
| Dual Tube Night Vision Goggle | Night Optics USA | D-221 | |
| Filter Paper, Grade No. 4 | Whatman, GE Healthcare | 1004-090 | |
| Fine Forceps, Dumont No. 5, Biologie, 11 cm long | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Fine Scissors, spring-loaded, 8 mm blade, straight | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP-1120 | 0.5% |
| Streptavidin-conjugated Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | 2% |
| Dextran rhodamine(high (> 10,000) MW) | Invitrogen | D1817 | 0.5% |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Zeiss 510 META Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
| OriginPro 8.0 | OriginLab |
References
- Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain. Neuron. 41, 495-511 (2004).
- Connors, B. W., Long, M. A.
- Vaney, D. I. Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin. Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).
- Bloomfield, S. A., Völgyi, B. The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina. Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).
- Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine. Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).
- Xin, D., Bloomfield, S. A. Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).
- Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling. Neuron. 59, 790-801 (2008).
- Ribelayga, C., Mangel, S. C. Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina. PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).
- Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway. Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).
- Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP. Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).
- Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes. Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).
- Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimarães, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina. J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).
- Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina. J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).
- Mills, S. L., Massey, S. C. The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).
- Mills, S. L., Massey, S. C. A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina. J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).
