Fotólisis de compuestos enjaulados permite la producción de aumentos rápidos y localizados en la concentración de diversos compuestos fisiológicamente activos. Aquí, se muestra cómo obtener el patch-clamp grabaciones en combinación con la fotólisis de AMPc jaula o jaulas Ca para el estudio de la transducción olfativa en disociada del ratón neuronas sensoriales olfativas.
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Artículo de método
Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas
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Resumen
Resumen
Fotólisis de compuestos enjaulados permite la producción de aumentos rápidos y localizados en la concentración de diversos compuestos fisiológicamente activos 1. Compuestos enjaulados son moléculas hechas fisiológicamente inactivo por una jaula de sustancia química que puede ser rota por un destello de luz ultravioleta. Aquí, se muestra cómo obtener el patch-clamp grabaciones en combinación con la fotólisis de compuestos enjaulados para el estudio de la transducción olfativa en disociada del ratón neuronas sensoriales olfativas. El proceso de transducción olfativa (Figura 1) lleva a cabo en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas, que une a los receptores odorantes conduce al aumento de AMPc que se abre de nucleótidos cíclicos-dependientes (GNC) 2 canales. Entrada de Ca a través de los canales de GNC activa Ca-Cl canales activados. Mostramos cómo disociar las neuronas del epitelio olfatorio de ratón 3 y la forma de activar los canales de GNC o Ca-Cl canales activados por fotólisis de AMPc jaula de 4 o 5 jaulas Ca </ Sup>. Nosotros utilizamos una lámpara de flash 6,7 aplicar destellos ultravioleta a la región ciliar a desenjaular cAMP o Ca, mientras patch-clamp grabaciones se toman para medir la corriente en el conjunto de células voltaje-clamp configuración 08/11.
Protocolo
1. Instrumentación
- Para medir la respuesta de las neuronas sensoriales olfativas a la fotólisis de compuestos enjaulados, utilizamos una lámpara de destellos en combinación con un sistema típico de registro de parche, que incluye: un amplificador de parche, un electrodo de registro y un electrodo de referencia conectados al cabezal del amplificador de parche, un digitalizador, una computadora, software para la adquisición de datos, micromanipuladores, un microscopio de epifluorescencia, un sistema de perfusión, una mesa antivibraciones y una jaula de Faraday (Figura 2).
- Para generar un destello de luz ultravioleta (UV) de alta intensidad, utilizamos una lámpara de destellos de xenón (Unidad de Flash JML-C2 de Rapp OptoElectronic, Figura 3A) que funciona descargando un condensador de alto voltaje a través de un tubo de arco corto lleno de gas xenón6-7. El destello de luz puede activarse manualmente o mediante la computadora, utilizando el mismo software que controla la adquisición electrofisiológica.
- Un filtro paso corto UV optimizado para aplicaciones de desenjaulamiento (270-390 nm) se inserta en una ranura de salida de la lámpara de destellos y una guía de luz de fibra óptica de cuarzo se conecta al microscopio (ver 1.5).
- La intensidad del destello de luz y, por lo tanto, el grado de fotólisis, puede modificarse cambiando parámetros específicos:
voltaje o capacitancia6. De hecho, la intensidad de la luz está relacionada con la energía almacenada en el condensador y depende del valor de la capacitancia y del voltaje aplicado, según la relación estándar 0.5 CV2. En el panel frontal de nuestra lámpara de destellos se puede seleccionar uno de tres valores de capacitancia (C1=1000 μF, C2=2000 μF o C3=3000 μF) y el voltaje puede variarse entre 100 y 385 voltios (Figura 3A), produciendo una energía almacenada que oscila entre 5 y 220 J. La duración del destello varía entre 0,5 y 1 ms a media altura máxima y depende del valor de capacitancia seleccionado. Antes de seleccionar una capacitancia diferente o establecer un voltaje más bajo, es necesario descargar el condensador, seleccionando el modo de descarga en el panel frontal de la lámpara de destellos (Figura 3A).
Sin embargo, la energía luminosa no es simplemente proporcional a la energía almacenada debido a múltiples factores relacionados con la física de las descargas gaseosas y a pérdidas no lineales en el circuito al aumentar la energía eléctrica6. Para medir la energía asociada a un destello de luz, puede utilizarse un joulemetro, como el JM10 proporcionado por RappOptoElectronics. Téngase en cuenta que la energía a la salida de la guía de luz de cuarzo con el filtro UV colocado está en el rango de 1-15 mJ por destello, según se indica en la guía del usuario de la Unidad de Flash de Rapp OptoElectronic.
Un conjunto de fotodiodo (Figura 3B) se proporciona con la unidad de lámpara de destellos y puede utilizarse para estimar las variaciones de intensidad luminosa en función de C y V. De hecho, la salida del fotodiodo es proporcional a la intensidad de la luz. Siguiendo las instrucciones del manual del usuario, la guía de luz se conecta a la entrada del conjunto de fotodiodo, mientras que la salida se conecta a un osciloscopio. La Figura 3C muestra el voltaje de salida máximo del fotodiodo en respuesta a destellos de luz para los tres valores de capacitancia C1, C2 o C3 disponibles en nuestra unidad de lámpara de destellos, en función del voltaje aplicado. Estos valores cambiarán a medida que la lámpara de destellos envejezca. Es recomendable utilizar regularmente el fotodiodo para verificar el deterioro de la lámpara de destellos.
En lugar de modificar la capacitancia y/o el voltaje en el panel frontal, un control más preciso y rápido de la intensidad luminosa se obtiene colocando filtros de densidad neutra en una segunda ranura de filtro de la lámpara de destellos (Figura 3A). Este enfoque es más rápido y, además, no se modifica la duración del destello, que depende del valor de capacitancia seleccionado. Con filtros de densidad neutra que varían desde una transmisión del 100 % hasta el 0,1 %, la intensidad del destello puede modificarse rápidamente en un amplio rango. - El destello de luz se dirige a la neurona, sembrada en placas con fondo de vidrio, a través de una guía de luz de fibra óptica de cuarzo (Figura 2). La guía de luz se conecta al accesorio de epifluorescencia del microscopio invertido mediante un adaptador. Un cubo de filtro modificado, sin filtro de excitación, dirige el haz UV a la neurona mediante un espejo dicróico.
- La luz se enfoca a través de un objetivo de inmersión en aceite de 100x. El área cubierta por el destello se visualiza insertando la guía de luz en un iluminador que proporciona una fuente continua de luz visible. La imagen (representada en amarillo en el video) se observa en un monitor mediante una cámara CCD conectada al microscopio. Se dibuja el contorno del área iluminada en el monitor para localizar la zona del destello UV para los experimentos. Antes de aplicar el destello UV, se posiciona la región ciliar de la neurona dentro del área dibujada en el monitor.
- El tamaño del punto de luz UV está controlado por la magnificación del objetivo, el diámetro de la guía de luz y la posición de la guía de luz en la parte trasera del microscopio. Utilizamos un objetivo de inmersión en aceite con una magnificación de 100x. El diámetro del punto circular se mide dirigiendo la luz de un iluminador hacia una regla micrométrica colocada sobre la platina del microscopio. El diámetro del punto en nuestro montaje es aproximadamente de 16, 33, 50 o 105 μm para una guía de luz con un diámetro de 200, 400, 600 o 1250 μm, respectivamente.
2. Preparación de soluciones
Disección
- Solución de Ringer: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucosa, 1 mM piruvato de sodio (pH 7.4 ajustado con NaOH 1 M).
- Solución de detención: solución de Ringer con 0,1 mg/ml de BSA, 0,3 mg/ml de leupeptina y 0,02 mg/ml de DNasa I.
- Solución de Ringer sin cationes divalentes: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM glucosa, 1 mM piruvato de sodio (pH 7.4 con NaOH 1 M). Añadir 200 μM cisteína y 2 U/ml de papaína para la disociación enzimática.
Nota: Filtrar estérilmente las soluciones para la disección.
Soluciones para registros con parche de electrodo
Soluciones extracelulares
- Solución extracelular de Ringer: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucosa, 1 mM piruvato de sodio (pH 7,4 ajustado con NaOH 1 M).
- Solución de Ringer con bajo contenido de Ca: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucosa, 1 mM piruvato de sodio (pH 7,4 ajustado con NaOH 1 M).
Soluciones intracelulares
Prepare siempre las soluciones de compuestos enjaulados y úselas con luz tenue para evitar la degradación de los compuestos enjaulados por la luz ambiental. Proteja los recipientes de la luz utilizando papel de aluminio.
AMPc fotoencapsulada:
- Prepare una solución intracelular que contenga 145 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgATP y 0,1 mM NaGTP (pH 7,4 ajustado con KOH 1 M).
- Prepare una solución stock disolviendo cAMP atrapado (BCMCM-cAMP4) en DMSO a 50 mM. Haga alícuotas de 5 μl. Almacene hasta un año a -20°C.
- Disuelva una alícuota de la solución stock de cAMP atrapado en la solución intracelular para obtener una concentración final de 50 μM de cAMP atrapado. Mezcle utilizando un vórtex.
- Haga alícuotas de 1 ml de la solución intracelular con cAMP atrapado. Almacene hasta dos meses a -20°C hasta su uso.
Calcio atrapado:
Preparamos soluciones intracelulares que contienen DMNP-EDTA 3 mM5 cargado al 50 % con Ca 1,5 mM.
- Prepare una solución intracelular que contenga 140 mM KCl (o CsCl), 10 mM HEPES (pH 7,4 ajustado con KOH 1 M o CsOH).
- Abra un vial de 5 mg de DMNP-EDTA. Añada 52,8 μl de una solución estándar de cloruro de calcio 0,1 M y 1 ml de solución intracelular. Mezcle utilizando un vórtex.
- Para evitar la liberación del calcio atrapado por la luz ambiental, transfiera la solución a un tubo protegido de la luz con papel de aluminio. Añada solución intracelular hasta alcanzar un volumen final de 3,5 ml. Mezcle utilizando un vórtex. Prepare alícuotas de aproximadamente 1 ml de la solución intracelular con calcio atrapado y almacénelas hasta dos meses a -20°C hasta su uso.
Notas: Durante los experimentos, proteja las soluciones del compuesto enjaulado de la luz utilizando papel de aluminio y manténgalas sobre hielo. Filtre estérilmente la solución intracelular.
3. Disociación de neuronas sensoriales olfativas de ratón
Los animales se manipularon de acuerdo con las Guías Italianas para el Uso de Animales de Laboratorio (Decreto Legislativo 27/01/1992, no. 116) y las directrices de la Unión Europea sobre investigación con animales (No. 86/609/EEC).
- Prepare tres placas de vidrio con fondo de vidrio recubierto con concanavalina-A al 10 mg/ml y poli-L-lisina al 10 mg/ml.
- Para preparar la disección, prepare 1 ml de solución de Ringer sin iones divalentes. Llene dos placas de Petri de 50 mm recubiertas con Sylgard con solución de Ringer y colóquelas sobre hielo. Enfriar también una mezcla de papaina-cisteína, 0,5 ml de la solución de parada y una jeringa con un filtro de 0,22 μm que contenga aproximadamente 10 ml de solución de Ringer.
- Sacrifique un ratón mediante asfixia con CO2 seguida de decapitación. Retire la piel que recubre el cráneo, corte a lo largo de las líneas de la mandíbula y coloque la cabeza en una placa de Petri recubierta con Sylgard.
- Coloque la placa bajo un estereomicroscopio. Utilizando un escalpelo, divida sagitalmente la cabeza a lo largo de la línea media. Gire la mitad de la cabeza con el lado medial hacia arriba. Retire cuidadosamente el tabique para exponer los cornetes (véase también Cygnar et al., 201013).
- Utilizando pinzas número 3 y un escalpelo, retire los cornetes revestidos con epitelio olfatorio. Transfiera a una placa de Petri recubierta con Sylgard.
- Con pinzas superfinas número 55, separe los fragmentos de epitelio olfatorio de las partes adyacentes de los cornetes. Trasládelos a un tubo que contenga 1 ml de solución de Ringer sin iones divalentes. Añada la mezcla de papaina y cisteína. Con tijeras microquirúrgicas, pique finamente los epitelios e incube a temperatura ambiente durante 3 minutos. Vuelva a picar suavemente con las tijeras microquirúrgicas y espere 5 minutos adicionales.
- Utilizando una pipeta Pasteur pulida con llama, transfiera a un tubo que contenga 0,5 ml de la solución de parada.
- Centrifugue a 300 g (1500 RPM) durante 5 minutos. Descarte el sobrenadante y añada aproximadamente 1 ml de solución de Ringer filtrada. Triture suavemente con una pipeta Pasteur pulida con llama.
- Siembre alrededor de 0,3 ml de la solución que contiene las células en el centro de las tres placas de vidrio con fondo de vidrio. Deje que las células sedimenten durante aproximadamente una hora a +4°C. Añada solución de Ringer.
4. Grabación
- Prepare pipetas de registro a partir de capilares de borosilicato para obtener resistencias de 3-7 MΩ cuando se llenan con la solución intracelular.
- Coloque un platillo con fondo de vidrio que contenga neuronas sensoriales olfativas disociadas sobre la platina del microscopio invertido. Perfunda con solución de Ringer.
- Proteja una jeringa que contiene la solución intracelular con compuestos fotoencarcelados de la luz con papel de aluminio y manténgala refrigerada. Trabaje con luz tenue para evitar la degradación de los compuestos fotoencarcelados por la luz ambiental.
- Busque una neurona sensorial olfativa aislada con cilios intactos a un aumento de 100x. Mueva la platina del microscopio para posicionar la región ciliar dentro del círculo dibujado en la pantalla, con el fin de localizar el área previamente identificada para el destello de UV.
- Llene una pipeta de registro con la solución intracelular que contiene el compuesto fotoencarcelado utilizando una aguja flexible. Elimine las burbujas de la punta de la pipeta. Inserte la pipeta en el soporte del cabezal del amplificador de registro en modo parche y acérquese al soma de la neurona usando el micromanipulador. Aplique succión suave para obtener un sello del orden de gigaohmios. Establezca el voltaje en -60 mV y aplique succión adicional para alcanzar el modo de célula íntegra, utilizando técnicas estándar de registro en modo parche12.
- Espere al menos dos minutos para permitir la difusión del compuesto fotoencarcelado hacia los cilios.
- En el ordenador, inicie un protocolo de estimulación y registre la respuesta. Utilice un filtro pasa-bajos de 1 kHz y digitalice con una frecuencia de muestreo de al menos 2 kHz.
- Un protocolo de estimulación típico mantiene el voltaje en un valor constante y desencadena la emisión de un destello de UV procedente de la lámpara de destellos para la fotólisis del compuesto fotoencarcelado en la región ciliar.
5. Resultados representativos:
Debe ser capaz de producir una fotodescage local de AMPc fotoactivable o de Ca fotoactivable en la región ciliar de una neurona sensorial olfativa aislada y registrar la respuesta de corriente en la configuración de bloqueo de voltaje en toda la célula.
La figura 4 muestra una corriente entrante típica provocada por un destello de luz ultravioleta que produce la fotólisis del cAMP encagestado, registrada a un voltaje de -60 mV en presencia de una solución de Ringer extracelular con bajo contenido de Ca. En estas condiciones, la corriente entrante se debe a la entrada de Na a través de canales CNG. La fase ascendente de la corriente fue rápida y se ajustó mediante una función exponencial simple con una constante de tiempo de 3,4 ms.
Las figuras 5A-B muestran las respuestas de otra neurona sensorial olfativa en solución con bajo contenido de Ca y en solución de Ringer con Ca 1 mM. La fase ascendente de la corriente a -60 mV se volvió mucho más lenta y multifásica (Figura 5 A-B). Esto se debe a la acción del Ca que entra en las cilias a través de los canales CNG y activa una corriente secundaria de Cl10. El componente catiónico anterior de la corriente, debido a la activación de los canales CNG, es menor en la solución de Ringer con 1 mM de Ca que en la solución con bajo contenido de Ca, debido al bloqueo provocado por los iones Ca que penetran y reducen la corriente total.
Otra forma de reducir el aumento de Ca en los cilios consiste en fijar el potencial del neutrón a +60 mV (Figura 5 C-D). La fase ascendente de la respuesta debida a la liberación de cAMP a +60 mV se describió adecuadamente mediante una exponencial simple con una constante de tiempo de 6,7 ms, lo que indica la presencia de un solo componente de corriente.
Al liberar Ca mediante fotólisis dentro de los cilios de una neurona sensorial olfativa, debería ser posible medir una corriente ascendente rápida. Esta corriente es transportada por iones Cl⁻. La figura 6 A muestra corrientes entrantes a -50 mV inducidas por la liberación fotolítica de Ca atrapado en respuesta a destellos de UV de diferentes intensidades. La fase ascendente de las corrientes de Cl⁻ activadas por Ca²⁺ se describió adecuadamente mediante una exponencial simple con constantes de tiempo que varían entre 3,8 y 5 ms (figura 6 B).
Figura 1. Transducción olfativa en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas. Las moléculas odoríferas se unen a receptores de olores (OR), activando una proteína G que a su vez activa la adenilil ciclasa (ACIII), lo que provoca un aumento intracelular de AMPc. El AMPc abre los canales activados por nucleótidos cíclicos (CNG), permitiendo la entrada de iones Na y Ca. El aumento del Ca intracelular activa los canales de Cl regulados por Ca. Se puede introducir AMPc fotoliberable o Ca fotoliberable en los cilios mediante difusión a través de una pipeta de registro. Un destello de luz ultravioleta produce la fotólisis del compuesto fotoliberable (modificado, con permiso, de Pifferi et al. 20062).
Figura 2. El sistema de registro con parche y fotólisis por destello. Los componentes del montaje incluyen un amplificador de parche, un ordenador, un digitalizador, un microscopio de epifluorescencia, una lámpara de destello de xenón, una cámara CCD y un monitor. Las líneas azules y violetas indican respectivamente las trayectorias de luz visible y UV.
Figura 3. Lámpara de destello de xenón. (A) Fuente de luz utilizada para la fotólisis de compuestos enjaulados. (B) Módulo de fotodiodo empleado para evaluar la intensidad del destello de luz. (C) La guía de luz de la lámpara de destello se conectó a la entrada del fotodiodo y la salida se visualizó en un osciloscopio. Uno de los tres valores de capacitancia disponibles (C1, C2 o C3) se seleccionó mediante el interruptor del panel frontal de la lámpara de destello y el voltaje se ajustó girando el mando del panel frontal. El voltaje de salida del fotodiodo en respuesta a diferentes intensidades de destello se representó frente al voltaje aplicado para cada valor de capacitancia: C1 = 1000 μF, C2 = 2000 μF o C3 = 3000 μF. Se utilizó una guía de luz de 600 μm de diámetro.
Figura 4. Registro mediante parche adherido en respuesta a la fotólisis de cAMP encageado en una solución extracelular de bajo Ca²⁺. (A) Respuesta de la corriente en todo el célula inducida en una neurona sensorial olfativa aislada mediante la fotólisis de cAMP encageado localizado en los cilios. Un destello de luz ultravioleta se liberó en el momento indicado por la flecha. El potencial de sostenimiento fue de -60 mV. (B) La fase ascendente de la corriente se ajustó adecuadamente con una función exponencial simple (línea punteada) con una constante de tiempo de 3,4 ms.
Figura 5. Respuestas de corriente inducidas por la fotólisis de AMPc atrapado en condiciones de bajo Ca y en soluciones de Ringer. (A) Una neurona sensorial olfativa fue sumergida en solución de Ringer que contenía 1 mM de Ca o en solución de bajo Ca, a un potencial de reposo de -60 mV. Un destello de luz ultravioleta se liberó en el momento indicado por la flecha. (B) Las respuestas de corriente representadas en una escala de tiempo ampliada mostraron una fase ascendente multifásica en la solución de Ringer, mientras que la fase ascendente se ajustó bien a una función exponencial única (línea punteada) con una constante de tiempo de 3,5 ms para la respuesta registrada en la solución de bajo Ca. (C) Respuestas de corriente de la misma neurona mostrada en (A), sumergida en solución de Ringer a potenciales de reposo de -60 y +60 mV. (D) Las respuestas de corriente representadas en una escala de tiempo ampliada mostraron una fase ascendente multifásica a -60 mV, mientras que a +60 mV la fase ascendente se ajustó bien a una exponencial única con una constante de tiempo de 6,7 ms (línea punteada).
Figura 6. Respuestas a la fotólisis del calcio atrapado. (A) Corrientes en célula completa inducidas por la fotólisis del calcio atrapado a -50 mV. Los destellos de luz ultravioleta se aplicaron en el momento indicado por la flecha. Las intensidades de los destellos se variaron mediante filtros de densidad neutra. (B) Escala de tiempo expandida que muestra el aumento rápido de la corriente tras la liberación fotoinducida de calcio. Las corrientes se ajustaron bien mediante una función exponencial simple (líneas punteadas), con constantes de tiempo de 5, 4,8 y 3,8 ms. (Reproducido, con autorización, de Boccaccio & Menini, 200710).
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Discusión
Flash fotólisis de compuestos enjaulados en combinación con patch-clamp grabaciones es una técnica útil para obtener saltos rápidos y locales en la concentración de las moléculas fisiológicamente activas, tanto dentro como fuera de las células. Existen varios tipos de compounds1 enjaulados han sido sintetizados, y esta técnica se puede aplicar a diferentes tipos de células, incluyendo células cultivadas que expresan canales iónicos que pueden ser activadas o modulada por fotólisis de algunos de los compuestos disponible...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Adaptador de módulo de lámpara de flash a microscopio | Rapp optoelectrónica | FlashCube 70 | |
| Aire mesa | TMC | MICRO-63-534 g | |
| Digitalizador | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Software de Adquisición de Datos | Axon Instruments | pCLAMP 8 | |
| Software de análisis de datos | WaveMetrics | Igor | |
| Espejo para el módulo de adaptador | Rapp optoelectrónica | M70/100 | |
| Portaelectrodos | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Jaula de Faraday | Una medida que se | ||
| Cubo de filtro | Olimpo | U-UTH | Filtro de excitación eliminado |
| Lámpara de flash | Rapp optoelectrónica | JML-C2 | |
| Pinzas Dumont # 55 | Mundial de Instrumentos de Precisión | 14099 | |
| Capilares de vidrio | Mundial de Instrumentos de Precisión | PG10165-4 | |
| Vidrio placa inferior | Mundial de Instrumentos de Precisión | FD35-100 | |
| Iluminador | Olimpo | Resalte 3100 | |
| Microscopio invertido | Olimpo | IX70 | |
| Micromanipuladores | Luigs y Neumann | SM I | |
| Micropipeta Extractor | Narishige | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Filtros de densidad neutra | Omega Optical | varía | |
| Objetivo 100X | Zeiss | Fluar 440285 | Ya sea Zeiss o Olympus |
| Objetivo 100X | Olimpo | UPLFLN 100XOI2 | Ya sea Zeiss o Olympus |
| Óptica UV filtro paso corto | Rapp optoelectrónica | SP400 | |
| Patch-clamp amplificador | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Foto Asamblea Diodo | Rapp optoelectrónica | PDA | |
| Guía de luz de cuarzo | Rapp optoelectrónica | varía | Nosotros utilizamos 600 m de diámetro |
| Alambre de plata | Mundial de Instrumentos de Precisión | AGT1025 | |
| Plata baja de pellets | Warner instrumentos | 64-1309 | |
| Lámpara de arco de xenón | Rapp optoelectrónica | XBL-JML |
| Reactivo | Empresa | Número de catálogo |
|---|---|---|
| BCMCM-jaula AMPc | Biolog | B016 |
| Albúmina de suero bovino (BSA) | Sigma | A8806 |
| CaCl2 solución estándar de 0,1 M | Fluka | 21059 |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 |
| Cisteína | Sigma | C9768 |
| Concanavalina A de tipo V (ConA) | Sigma | C7275 |
| CsCl | Sigma | C4036 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| DNAsa I | Sigma | D4527 |
| EDTA | Sigma | E9884 |
| EGTA | Sigma | E4378 |
| Glucosa | Sigma | G5767 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| KCl | Sigma | P3911 |
| KOH | Sigma | P1767 |
| Leupeptina | Sigma | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| Papaína | Sigma | P3125 |
| Poli-L-lisina | Sigma | P1274 |
| NaCl | Sigma | S9888 |
| NaOH | Sigma | S5881 |
| NaPyruvate | Sigma | P2256 |
Referencias
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
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- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
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- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
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- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
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- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
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Reimpresiones y permisos
